Utilité de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative dans le diagnostic de la leptospirose: association du niveau de leptospiremia et des manifestations cliniques au Sri Lanka

Voir le commentaire éditorial de Katz, pages 1256-8Background Réaction quantitative en chaîne par polymérase qPCR, malgré les coûts et les difficultés logistiques, peut fournir un diagnostic précis et opportun de la leptospirose au point de traitement dans les zones endémiques. Un nouveau test qPCR utilisant des amorces Taqman du gène de l’ARN ribosomique 16S spécifique de Leptospira et un protocole de réduction de température optimisé a été utilisé pour analyser les échantillons de sang du patient viagra pour femme en pharmacie. Le sérum a été comparé au sang total. La leptospirémie quantitative a été comparée aux manifestations cliniques de la leptospirose et à ses résultats Résultats La sensibilité diagnostique de qPCR du sang total et du sérum était de 184% Intervalle de confiance à 95% [IC]: 997% -314% et 510% IC à 95%: 375% – 644% respectivement La qPCR sur les cas suspects a confirmé l’infection dans 58 des 381 cas 152% Parmi ces cas, 6 cas co confirmée par réaction en chaîne par polymérase nichée La PCR et le séquençage étaient sérologiquement négatifs en utilisant un panel d’agglutination microscopique standard mais non régionalement optimisé. La charge bactérienne dans le sérum / sang variait de 102 à 106 Leptospira / mL Charge médiane de leptospirose pour insuffisance rénale, myocardite et -les patients en échec organique étaient 8616, 11007, 36100 et 15882 Leptospira / mL respectivement. La fenêtre de positivité de qPCR allait du jour 2 au jour 15; P = 328Conclusions La PCR quantitative montre le potentiel comme un test de diagnostic valide avec une fenêtre de positivité plus large que ce que l’on pensait auparavant. La leptospirémie quantitative dans les échantillons de sérum / sang total n’a pas été affectée par la PCR quantitative. pas directement en corrélation avec les manifestations cliniques des résultats dans cette population de patients

La leptospirose affecte principalement les populations pauvres et marginalisées dans les pays tropicaux et subtropicaux L’incidence médiane de la leptospirose humaine dans les pays hautement endémiques atteint 975 pour 100000 personnes. Des complications graves menaçant le pronostic vital en raison de lésions rénales aiguës et pulmonaires aiguës sont fréquentes. 67% et 87% respectivement [1] Le test d’agglutination microscopique MAT et la culture utilisée pour diagnostiquer la leptospirose ne sont disponibles que dans les laboratoires de référence. MAT est limité par sa subjectivité, nécessite le maintien de Leptospira vivant et nécessite un échantillon convalescent pour des résultats concluants La culture est insensible et nécessite une incubation prolongée jusqu’à 3 mois L’absence de disponibilité des résultats de diagnostic par rapport aux soins des patients entrave la prise en charge clinique de la leptospirose et rend difficile l’évaluation de la charge de cette maladie. [2] Po quantitative Réaction en chaîne de la lymérase Les tests basés sur qPCR sont plus sensibles que les tests de PCR conventionnels et permettent de mesurer la charge bactérienne dans les échantillons cliniques. Une analyse récente des tests qPCR basés sur SYBR green et Taqman utilisés dans le diagnostic de la leptospirose a montré que les méthodes publiées Cependant, la sensibilité diagnostique de la qPCR dans les échantillons cliniques est inférieure à celle des MAT [3]. En application clinique, l’urine, le sang total, le sérum et le plasma ont été utilisés comme types d’échantillons pour analyse, mais publiés. Des études ont montré des résultats mitigés sur la détection d’antigène dans différentes fractions sanguines [4, 5] Pour l’application clinique des méthodes qPCR, des données sont encore nécessaires pour déterminer les types d’échantillons optimaux Un seuil critique de 104 bactéries / mL a été rapporté sur la base de 12 cas confirmés [6] Au Pérou, un seuil similaire a été associé avec des manifestations pulmonaires sévères basées sur seulement 7 cas [7] Des études approfondies d’autres maladies virales et bactériennes indiquent que la charge pathogène dans le sang est un prédicteur principal de la sévérité de la maladie [8-14] Quantification de la charge pathogène dans ces maladies bactériennes. La cohorte de patients atteints de leptospirose confirmée en laboratoire est caractérisée par l’utilité diagnostique de l’analyse qPCR des échantillons de sérum et de sang total. Elle étudie l’association entre la charge leptospirale et le résultat clinique. fenêtre de positivité pour qPCR

Méthodes

Unités d’étude et échantillons

Les échantillons de la présente étude proviennent d’une cohorte de patients systématiquement échantillonnés lors d’une épidémie de leptospirose au Sri Lanka en 2008. [15, 16] Cette cohorte de patients comprenait des échantillons de 381 fièvres aiguës fébriles & 15 jours avec une éventuelle leptospirose recrutée sur 3 principaux hôpitaux des districts de Kegalle, Kandy et Matale au centre de Sri Lanka Parmi ces échantillons, nous avons sélectionné 49 cas de leptospirose confirmée MAT-positive et 56 témoins MAT-négatifs. Parmi les 105 échantillons disponibles, seuls ces 105 patients avaient le premier échantillon de sang total / sérum recueillis dans les 10 jours suivant l’apparition des symptômes et leur deuxième échantillon convalescent prélevé après le 14e jour, tous les échantillons ayant un minimum de 7 jours entre le prélèvement aigus et le prélèvement convalescent. Le diagnostic standard de leptospirose était basé sur le MAT tel que décrit ailleurs [15]

Extraction d’ADN

L’ADN a été extrait de 100 μL de sérum ou de sang total en utilisant le kit DNeasy Blood and Tissue QIAGEN selon les instructions du fabricant. Pour la préparation de courbes standards avec des bactéries dopées pour l’extraction et les contrôles négatifs, le sang veineux a été prélevé chez un individu en bonne santé. interrogans serovar Copenhageni, souche L1-130 [17] cultivée en milieu liquide EMJH Ellinghausen-McCullogh-Johnson-Harris a été inactivée dans du formol à 10% pendant 15 minutes puis comptée dans une chambre de comptage de Petroff-Hausser. Les nombres connus de Leptospira vivants ont ensuite été augmentés dans le sang total / sérum et dilué pour donner des concentrations finales de 1 × 100 à 1 × 108. L’ADN de Leptospira / mL a été extrait comme décrit ci-dessus. Pour les témoins négatifs, le sang total / sérum non dopé du même individu sain a été extrait comme décrit.

Amorces quantitatives de réaction en chaîne de la polymérase et sondes

La PCR quantitative a été réalisée en utilisant la paire d’amorces lepto16S620f et lepto16S730r comme décrit par ailleurs [17] et la sonde interne 5′-CAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCAGA-3 ‘”16S Taqman probe1″ marquée avec le colorant rapporteur fluorescent FAM 6-carboxyfluorescéine à l’extrémité 5’, et Black Hole quencher un BHQ-1 à l’extrémité 3 ‘

Conditions de réaction en chaîne de la polymérase et identification d’échantillons positifs

Les réactions de PCR en triple ont utilisé iQ Supermix Bio-Rad avec des concentrations finales d’amorce et de sonde de 05 et 02 μmol / L, respectivement, et 5 μL d’échantillons d’ADN / courbes standards et contrôles dans 20 μL de volume de réaction en utilisant un moteur DNA Opticon 2 MJ au protocole suivant: 95 ° C pendant 3 minutes, 15 cycles de 10 secondes à 94 ° C, 45 secondes à 80 ° C; la température de recuit a été diminuée de 1 ° C par cycle jusqu’à 65 ° C; l’amplification s’est poursuivie pendant encore 24 cycles de 10 secondes à 94 ° C et 45 secondes à 65 ° C. Tous les positifs avaient un signal quantitatif dans la partie linéaire de la courbe standard supérieure au contrôle positif le plus bas.

Quantification de Leptospira dans le sang humain

Tous les échantillons positifs pour qPCR ont été réamplifiés à l’aide d’une courbe standard unique, et la quantification a été effectuée à l’aide du logiciel Opticon 2. Aucune quantification n’a été effectuée pendant la phase initiale de sélection afin de minimiser la variabilité entre les mesures.

Réaction en chaîne de polymérase imbriquée à un tube et séquençage

Les échantillons PCR positifs ont été amplifiés en utilisant un protocole de PCR nested précédemment publié [15] Les produits de PCR ont été purifiés en utilisant le SVG Wizard SV et le PCR Clean-Up System Les produits PCR purifiés ont été clones dans le vecteur de clonage Topo pCR21 Invitrogen et transformés en cellules Escherichia coli TOP10F. La construction de plasmide a été isolée et purifiée en utilisant QIAprep Miniprep Kit QIAGEN avant le séquençage

L’analyse des données

Nous avons utilisé des proportions et un intervalle de confiance à 95% CI pour analyser la sensibilité de la qPCR dans les échantillons de sérum et de sang total. La spécificité n’a pas été calculée en raison de l’absence d’un véritable étalon-or; les contrôles étaient des patients atteints de fièvre probable chez qui la leptospirose était exclue en utilisant un échantillon apparié MAT Toutes les données catégoriques sont présentées en proportions et en pourcentages Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer la durée de la maladie entre les échantillons positifs et négatifs.

Protections des sujets humains

Cette étude a été approuvée par le Comité de révision éthique de la faculté de médecine de l’Université de Peradeniya, Sri Lanka. Du sang humain a été prélevé pour un travail expérimental selon un protocole approuvé par le Programme de protection des sujets humains de l’UCSD.

RÉSULTATS

Comparaison de la sensibilité diagnostique de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour le sérum et le sang total

Comparé à MAT, la sensibilité diagnostique de qPCR du sang total était de 184% IC à 95%: 997% -314% et 510% IC à 95%: 375% -644% pour le sérum Tableau 1 Différence observée des proportions positives entre sérum et sang total était très significatif P = 0007 Deux patients MAT-négatifs avaient des résultats qPCR positifs; Les deux patients ont été hospitalisés avant le 7ème jour de la maladie, avec fièvre, maux de tête et prostration. À l’examen, les deux patients présentaient une légère suffusion conjonctivale et une légère sensibilité musculaire. L’analyse d’urine a détecté de l’albumine et des globules rouges. le premier patient, alors que les fonctions hépatique et rénale étaient normales Le deuxième patient avait une biochimie sanguine et urinaire normale Les deux patients étaient sortis de l’hôpital sans aucune complication L’amplification STNPCR PCR monocanal était positive et le séquençage confirmait l’infection par L interrogans sans autre identification

Tableau 1Comparaison de la sensibilité diagnostique de la réaction en chaîne de la polymérase quantitative pour le sérum et le sang total pour la leptospirose T MAT Positif Négatif n% n% Total Sang total Positif 9 184 1 18 10 Non détecté 40 816 55 982 95 Total 49 1000 56 1000 105 Sérum Positif 25 510 1 18 26 Non détecté 24 490 55 982 79 Total 49 1000 56 1000 105 MAT Positif MAT Négatif n% n% Total Sang total Positif 9 184 1 18 10 Non détecté 40 816 55 982 95 Total 49 1000 56 1000 105 Sérum Positif 25 510 1 18 26 Non détecté 24 490 55 982 79 Total 49 1000 56 1000 105 Abréviation: MAT, test d’agglutination microscopiqueView Large

Confirmation de cas et identification d’espèces

La PCR quantitative a été utilisée pour confirmer le diagnostic de leptospirose chez 381 patients fiévreux regroupant la même population de patients [15], incluant les 105 patients analysés précédemment. Un total de 58 152% des cas ont été détectés par qPCR. Tableau 2 Parmi ces 20 nouveaux cas confirmés, 6 patients avaient des résultats négatifs au MAT, dont 2 patients utilisés dans le sérum-sang total. comparaison, 2 autres patients avaient un MAT négatif mais le second échantillon a été pris les jours 8 et 9 et les 12 autres patients n’ont pas eu de MAT en raison du manque d’échantillons appariés. Tous les 6 patients avec des résultats négatifs MAT dans les échantillons appariés étaient positifs dans STNPCR , et le séquençage était compatible avec L interrogans Au total, 26 cas étaient positifs dans STNPCR à l’exception des 6 patients positifs STNPCR qui ont été précédemment confirmés. d Les espèces de Leptospira étaient L interrogans 25 et L weilli 1 Il n’y avait aucune différence dans la manifestation clinique ou le résultat entre les patients qPCR-positifs vs qPCR-négatifs

Tableau 2 Diagnostic rétrospectif des cas probables de leptospirose à l’aide de la réaction en chaîne de la polymérase de 2008 Épidémie de leptospirose au Sri Lanka Disponibilité n Résultats n% Sang total et sérum 192 Les deux positifs 12 62 Sérum positif 24 125 Sang total positif 2 10 Non détecté 154 802 Sang total seulement 170 Positif 13 76 Non détecté 157 924 Sérum seulement 19 Positif 7 368 Non détecté 12 632 Total 381 Positif 58 152 Non détecté 323 848 Disponibilité n Résultats n% Sang total et sérum 192 Les deux positifs 12 62 Sérum positif 24 125 Sang total positif 2 10 Non détecté 154 802 Sang total seulement 170 Positif 13 76 Non détecté 157 924 Sérum seulement 19 Positif 7 368 Non détecté 12 632 Total 381 Positif 58 152 Non détecté 323 848 View Large

Fenêtre de Positivité

Dans un premier temps, nous avons comparé la fenêtre de positivité parmi les patients positifs au qPCR et les patients négatifs parmi les 49 cas positifs pour déterminer si la sensibilité de la PCR quantitative était affectée par le moment du prélèvement de l’échantillon. 8 et 5 IQR 5-6 jours pour les patients qPCR-positifs et -égatifs, respectivement Sensibilité de qPCR n’a pas été affectée par l’intervalle entre le début des symptômes et la collecte des échantillons chez les patients présentant de la fièvre 10 jours Mann-Whitney U test, P = Parmi les 381 cas étudiés, la qPCR était positive jusqu’au 15e jour après l’apparition de la fièvre. Figure 1 Parmi les 30 patients se présentant à l’hôpital entre 11 et 15 jours, 5 17% étaient positifs en qPCR contre 53 15% jours de fièvre

Figure 1View largeDownload slideWindow de positivité pour qPCR parmi 381 cas soupçonnés de leptospirose Abréviation: qPCR, réaction en chaîne polymérase quantitativeFigure 1View large slideDownloadWindow de positivité pour qPCR parmi 381 cas soupçonnés de leptospirose Abréviation: qPCR, réaction en chaîne de la polymérase quantitative

Comparaison du test d’agglutination microscopique en phase aiguë et de la réaction quantitative en chaîne par polymérase

Nous avons comparé le qPCR et l’échantillon aigu MAT échantillons de sang aigus obtenus dans les 15 jours de la fièvre pour déterminer l’utilité de ces tests Sur les 87 patients atteints de leptospirose confirmée précédemment par l’échantillon apparié MAT, 73 échantillons étaient disponibles pour le test qPCR dans la présente analyse. échantillons de sérum aigus disponibles pour ces 73 patients, 36 49% étaient positifs qPCR, alors que seulement 13 18% avaient un titre diagnostique MAT ≥1 / 400

Quantification de la charge bactérienne

La charge bactérienne dans le sérum / sang variait de 102 à 106 Leptospira / mL parmi 58 cas positifs La charge bactérienne médiane était 9577 Leptospira / mL IQR, 4623-49 580 / mL De 58 patients qPCR-positifs, 40 avaient une maladie non compliquée, 8 avaient un rein aigu lésion créatinine sérique> 15 mmol / L, 6 avaient une ECG de myocardite avec inversions d’ondes T et / ou élévations diffuses de ST avec ou sans insuffisance cardiaque, et 4 patients avaient une défaillance multiviscérale incluant insuffisance rénale et myocardite Aucun patient n’avait d’hémorragie pulmonaire. les résultats positifs de qPCR ont été comparés pour identifier toute association entre la charge bactérienne et les manifestations cliniques. Figure 2 La charge médiane de leptospirose pour les patients non compliqués, insuffisants rénaux, myocardites et échecs multi-organes était 8616 IQR, 4611-41727, 11007 IQR, 1102-17417, 36100 IQR, 11162-104067, et 15882 IQR, 7216-36871 Leptospira / mL, respectivement Bien que la charge bactérienne médiane était la plus faible dans le groupe non compliqué, la charge bactérienne n’était pas statistiquement différente de autres catégories de résultats Test U de Mann-Whitney, P = 59 Chez 40 patients de sexe masculin positifs pour la qPCR, la charge médiane de leptospirose était de 15640 Leptospira / mL IQR, 6053-53980 Leptospira / mL, et significativement test U de Mann-Whitney, P = 022 supérieur à celui des patientes médiane, 5611, IQR, 3891-14 383 Leptospira / mL

Figure 2View largeDownload slideDistribution de la bactériémie leptospirale parmi 58 patients positifs pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative, regroupés par complicationsFigure 2View largeDownload slideDistribution de la bactériémie leptospirale parmi 58 patients positifs en amplification en chaîne par polymérase positive, regroupés par complications

DISCUSSION

La charge est un facteur prédictif principal de la gravité de la maladie, notre étude a montré que des niveaux élevés de leptospiremia – comparables aux rapports précédents de leptospirose sévère / fatale – pouvaient survenir sans de telles complications Des études précédentes [24, 25] ont observé que était un facteur critique associé à des manifestations pulmonaires sévères et à la mort Dans notre étude, 17 patients avaient une charge bactérienne de> 104 germes / mL dans le sang total / sérum, mais n’avaient pas de complications sévères. en raison de la variabilité de la virulence entre les différentes espèces / sérovars / souches de leptospires Même dans notre échantillon de l’étude, des complications avec une faible charge bactérienne et sans complications avec un niveau élevé de charge bactérienne pourraient être dues à différents sérovars qui se manifestent différemment. les complications avec une charge bactérienne de 103 par mL sont difficiles à interpréter parce que le moment de l’échantillonnage n’a peut-être pas été au pois k leptospirémie Cependant, le nombre de patients dans chaque catégorie de complication était faible et d’autres études sont nécessaires pour renforcer cette observation. Dans cette étude, le sérum était un meilleur échantillon que le sang total pour obtenir l’ADN pour le qPCR diagnostique. échantillons, cette observation pourrait refléter le fait qu’il pourrait y avoir 2-3 fois plus d’ADN leptospiral par microlitre de sérum comparé au sang total, en supposant que Leptospira ne se trouve que dans le sérum. Cependant, ceci est une explication improbable car Leptospira phagocyté semble être concentrée dans la couche leucocytaire [5] De plus, la plupart des échantillons positifs pour le sérum / sang total étaient bien au-dessus de la limite théorique de détection de la qPCR 3 × 102 par ml dans les conditions utilisées. le sang comme les dérivés hème / hème [26], l’ADN leucocytaire de l’hôte [27] ou les anticoagulants ajoutés [28] présents dans les échantillons de sang total ont réduit l’efficacité Dans cette comparaison, nous avons utilisé uniquement la sensibilité mais pas la spécificité en raison de la limitation de la conception de l’étude et des diagnostics de leptospirose que nous avons utilisés pour la comparaison Premièrement, le groupe témoin n’était pas idéal mais les patients fébriles “Cas de leptospirose Bien que ces patients ont montré des résultats négatifs dans l’échantillon apparié MAT, il est difficile d’exclure le diagnostic parce que MAT n’est pas 100% sensible, comme confirmé dans cette étude En outre, le test idéal pour évaluer la démonstration directe de la présence de Leptospira dans des échantillons sanguins aigus, par exemple par une hémoculture positive Cependant, dans cette étude, en raison des limites des ressources, nous n’avons pas été en mesure d’effectuer des hémocultures sur des échantillons de patients; l’observation de Leptospira est néanmoins reconnue comme insensible en raison de la difficulté à isoler Leptospira fastidieuse. Une observation notable faite au cours de ce travail était significativement élevée chez les patients masculins. Les données épidémiologiques indiquent systématiquement que les hommes sont plus souvent atteints de leptospirose que les femmes; L’existence d’une explication biologique de cette observation ou l’exposition plus simple des mâles à Leptospira reste peu claire. Cependant, dans les populations animales où le biais d’exposition est minime, les mâles ont montré un taux de séropositivité plus élevé [29, 30] Cette observation préliminaire nécessite des investigations plus approfondies. Les données de cette étude doivent être identifiées. Premièrement, l’isolement de la culture des sérovars infectants n’a pas été effectué. La quantification et la corrélation clinique de la leptospirémie doivent idéalement être réalisées avec un dépistage systématique de la leptospirose. Il est difficile de faire cela parce que cela nécessiterait la suspension du traitement antibiotique. Néanmoins, l’utilité diagnostique de la qPCR a été faite en utilisant un échantillon de sang de phase aiguë prélevé à l’admission, ce qui reflète la pratique clinique. Môle Les tests cular que nous avons effectués n’ont pas différencié Leptospira infectant au-delà du niveau de l’espèce Nous avons essayé de réaliser le typage multilocus de MLST sur les spécimens qPCR-positifs dans cette étude, dont 12 suggèrent la présence d’un nombre limité de ST 1 n = 11 et ST44 n = 1 observations non publiées Enfin, les échantillons de cette étude ont été obtenus en 2008-2009, tandis que le qPCR a été réalisé en 2011. Pendant cette période, les échantillons ont été décongelés au moins 3-4 fois, ce qui pourrait La conclusion la plus importante que nous avons tirée de cette étude est que qPCR est prometteur comme outil de diagnostic rapide dans le diagnostic de la leptospirose aiguë avec une large fenêtre de positivité. Cependant, l’expertise technique et le coût nécessaire pour qPCR entravent encore son utilisation dans les milieux pauvres en ressources

Remarques

Remerciements

Nous tenons à remercier Jason S B Lehmann et Anne Spichler, MD, PhD, pour leurs conseils et contributions importants, en particulier pour soutenir le travail de qPCR. Nous remercions également Paula Maguina pour son expertise scientifique, administrative et logistique de ce travail.

Aide financière

Ce travail a été soutenu par les subventions US Public Health Service, 1RO1TW05860, 1U01AI075420, 1K24AI068903, 5R25GM083275 et 1D43TW007120

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués