Transmission de variants VIH-résistants aux médicaments: prévalence et effet sur les résultats du traitement

Contexte Le virus de l’immunodéficience humaine de type VIH – résistance aux médicaments est une menace importante pour le succès global du traitement antirétroviral ART En raison de la sensibilité limitée des dosages commerciaux, la résistance aux médicaments transmise peut être sous-estimée; L’objectif de cette étude était d’étudier la prévalence du TDR chez les patients infectés par le VIH et d’évaluer l’importance du TDR en ce qui concerne les résultats du traitement en analysant l’ARN viral plasmatique et périphérique. Dans une étude prospective, nous avons étudié le niveau de TDR chez les patients en comparant les résultats d’une approche multiplex-amorce-extension sensible appelée VIH-SNaPhot qui est capable de dépister le nucléoside commun. Vingt-deux patients ont été trouvés porteurs de mutations. Plus de patients avec TDR ont été identifiés par le test VIH-SNaPhot que par l’analyse de ViroSeq% vs%; P = Il n’y avait pas de différence significative entre le début du traitement antirétroviral et la suppression virologique entre les patients sensibles et ceux porteurs de mutations de résistance de faible ou de haut niveau ± écart type, ± vs ±; P = En outre, les analyses des numérations cellulaires CD n’ont montré aucune différence significative entre ces groupes année après l’initiation de la moyenne ART, contre les cellules / μL; P = Conclusion Nous avons trouvé que la prévalence du TDR chez les patients naïfs d’ARV récemment infectés était supérieure à celle estimée par le génotypage ViroSeq seul. Le suivi des patients après le début du traitement a montré une tendance à plus de complications cliniques chez les patients porteurs du TDR. un effet significatif sur les résultats du traitement n’a pas pu être démontré Par conséquent, la pertinence clinique des quasi-espèces résistantes à une faible abondance dans les infections précoces est toujours en cause

Bien que la thérapie antirétrovirale ait entraîné une baisse de la mortalité et de la morbidité chez les personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), l’émergence d’espèces virales pharmacorésistantes ne permet toujours pas de supprimer la virémie . la prévalence de la pharmacorésistance transmise par le TDR en Europe et en Amérique du Nord a été rapportée, allant de% à autant que% Cependant, les dernières études de surveillance européennes ont rapporté que la prévalence moyenne du TDR était constante, à un niveau de Ils ont observé que les patients portaient principalement uniquement des mutations TDR avec une fréquence accrue d’inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse NRTI ou de mutations de résistance aux médicaments NNRTI, ce qui reflète probablement l’utilisation intensive de ces classes de médicaments pour la dernière décennieUn problème pour nombre d’études estimant la prévalence du TDR est qu’elles sont basées sur ns du séquençage de population classique – une méthode connue pour avoir des problèmes de détection des quasi-espèces virales avec une fréquence de & lt;% En outre, des études antérieures ont échoué à expliquer les quasi-espèces virales archivées qui sont présentes dans les cellules mononucléaires du sang périphérique. l’approche de ces facteurs peut fournir une estimation plus précise de la fréquence de TDR ; En raison de l’augmentation de la sensibilité, la prévalence réelle du TDR peut être plus élevée que celle des estimations publiées actuelles. Cependant, une question importante doit encore être clarifiée: quelle est la signification clinique des patients porteurs du TDR lorsque le TAR est initié? Au cours des derniers mois ont abordé cette question à partir de différentes approches, toutes utilisant des méthodes de détection très sensibles pour mesurer la résistance dans le compartiment plasmique. Seules deux de ces études ont montré une influence significative sur la réponse au traitement chez les patients TDR à faible abondance. la prévalence du TDR a été rapportée en%, résumée dans une cohorte de patients avec une infection à VIH nouvellement diagnostiquée à partir d’une approche standard de génotypage. Dans la présente étude, nous avons étudié un sous-groupe de patients d’une cohorte clinique au Département des maladies infectieuses, Hôpital universitaire d’Aarhus Skejby, Danemark Nous avons examiné la présence de mutations majeures de résistance aux médicaments NRTI et NNRTI dans le plasma ainsi que dans l’ADN proviral des PBMC et nous avons abordé des questions importantes: le TDR est-il actuellement sous-estimé et le TDR à faible abondance affecte-t-il le traitement? résultat

Méthodes

Patients Nous avons utilisé les critères d’inclusion suivants: des échantillons de base ont été prélevés avant le début du traitement et aucun diagnostic de SIDA n’a été fourni. Deux lots d’échantillons de plasma ont été prélevés chez chaque patient à l’inclusion Un ensemble a été conservé à – ° C au Département des maladies infectieuses d’Aarhus Le temps d’infection a été estimé sur la base de la déclaration du patient et du dernier résultat négatif au test de dépistage des anticorps anti-VIH. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit à l’inclusion. Le test VIH-SNaPshot Ce test est une variante de la technique de miniséquençage dans laquelle une séquence de type sauvage ou mutante est détectée en utilisant un test de fluorescence unique. extension de l’amorce de base conjointement avec l’électrophorèse capillaire Le test VIH-SNaPshot est conçu pour identifier mutations dans les codons pour les mutations de résistance aux médicaments NRTI-ML, KR, KR, QM, MV et TYF, ainsi que les révertants TD / S / N et, en outre, les mutations de résistance aux médicaments NNRTI-KN, YC et GASE La méthode a été validée pour la variabilité des sous-types et a la capacité de détecter des résistances aux médicaments qui représentent seulement ~% de la population virale totale. Tests de résistance au VIH des échantillons d’ARN plasmatique , l’échantillon de plasma a été ultracentrifugé pendant min à, g, le volume excédentaire de plasma a été retiré avant que l’échantillon soit remis en suspension dans un tampon AVL, et l’ARN viral a été recueilli en utilisant le QIAamp Viral RNA Mini kit Qiagen, conformément aux instructions du fabricant. Réactions en chaîne par polymérase à transcription inverse en une seule étape Des RT-PCR ont été conçues pour chaque patient au moyen d’un protocole interne Suite à la PCR, les doubles ont été regroupés, kit de colonne GFX purifié sur gel; Des échantillons de plasma utilisés pour l’extraction de l’ARN, seuls des échantillons de PBMC patients étaient disponibles pour l’analyse. L’ADN génomique a été extrait à l’aide du kit QIAamp DNA Blood Mini QIAamp Gene amplification PCR spécifique a été réalisée sur μL d’ADN génomique ~ ng / μL avec pmol de chaque amorce FW et BW , × haute fidélité tampon, et U de Pfx ADN polymérase haute fidélité Invitrogen dans un -μL réaction dans les conditions de cycle suivantes: min à ° C; min à ° C; cycles de s à ° C, s à ° C et min à ° C; et une dernière étape d’extension de min à ° C. Les investigateurs ont été aveuglés aux profils de résistance de la méthode de génotypage ViroSeq jusqu’à ce que des analyses de comparaison aient été faites avec les résultats du test SNaPhots L’effet du TDR sur le résultat du traitement a été analysé en fonction de la susceptibilité. de leur régime initial d’ART; Cette analyse était basée sur la base de données de Stanford sur la pharmacorésistance du VIH, dans laquelle chaque mutation individuelle est classée comme étant soit sensible, de faible ou moyenne résistance, soit ayant une résistance élevée. Analyses statistiques Nous avons utilisé la statistique or ou le test exact de Fisher, comme Les variables continues ont été comparées à l’aide du test t de Student et de l’analyse de la variance -way. Les hypothèses ont été vérifiées par quantile-quantile, pour comparer les variables catégoriques de base pour les individus entièrement sensibles et ceux présentant une résistance faible ou élevée. tracés et le test de Bartlett Un tracé de Kaplan-Meier a été utilisé pour estimer le temps écoulé entre le début de l’ART et la charge virale plasmatique de suppression virale, & lt; copies / mL, selon le niveau de TDR; la méthode Gehan-Breslow-Wilcoxon a été appliquée pour tester les différences Nous avons utilisé le logiciel Stata, version StataCorp pour les analyses statistiques L’étude a été approuvée par l’Agence danoise de protection des données

Résultats

Caractéristiques de base Soixante et un patients ont été inclus dans le tableau de l’étude Quarante-cinq patients étaient entièrement sensibles, présentaient une faible résistance et présentaient une résistance élevée. Un patient n’a pas été traité et a donc été exclu du tableau d’analyse statistique. Les groupes de résistance de faible et de haut niveau ont été fusionnés en un groupe en raison du petit nombre d’observations dans le premier groupe. Les groupes étaient comparables en ce qui concerne l’âge, le sexe et le sous-type VIH. La voie d’infection était également répartie entre homosexuels et hétérosexuels. transmission Seul le patient a signalé un partage d’aiguilles et n’a pas pu fournir de renseignements sur le moment ou la voie d’infection. Dans le groupe sensible, les patients présentaient des mutations de résistance différentes qui n’ont pas affecté leur traitement antirétroviral initial selon les algorithmes de résistance et de traitement de Stanford. groupe de résistance de haut niveau, les patients ont porté & gt; mutation de résistance Le nombre de mutations de résistance détectées vs; P & lt; et le nombre de cellules CD à la ligne de base, vs cellules / μL; P = étaient les seules caractéristiques descriptives qui différaient significativement entre le groupe de résistance sensible et le groupe de résistance faible ou élevée

Table View largeTélécharger slideBaseline CharacteristicsTable Voir grandDownload slideBaseline Caractéristiques

Tableau View largeTélécharger slideRésistance mutations et traitement antirétroviral initial RegimenTable View largeDownload Mutations de résistance et traitement antirétroviral initial RegimenHIV- résistance aux médicaments par génotypage ViroSeq Le test de résistance au génotypage ViroSeq a été mené avec succès pour tous les patients. Les résultats ont montré que les patients avaient au moins une mutation NRTI ou NNRTI portaient des mutations liées à la résistance aux régimes NRTI, et portaient des mutations liées à la résistance aux régimes NNRTI tableau En outre, les patients portaient des polymorphismes naturels; Cependant, l’algorithme de résistance de Stanford ne les prédisait pas à interférer avec la résistance ARTP de l’ARN viral. Le gène de la transcriptase inverse a été amplifié avec succès à partir de l’échantillon de référence correspondant pour tous les patients. Le test VIH-SNaPhot a été positif pour le type sauvage. et / ou des codons de mutation à toutes les positions de mutation, à l’exception de l’amorce YC chez% des patients et de l’amorce KR chez% des patients Au total,% des patients hébergeaient ou présentaient des mutations de résistance NRTI ou NNRTI de faible abondance dans l’ARN viral plasmatique. ont trouvé que les mutations les plus fréquemment observées étaient les mutations associées à la thymidine TY / F / [%] et KR / [%], suivies par la mutation de résistance primaire NNRTI KN / [%] En outre, nous avons trouvé MV chez les patients% et YC mutation chez le patient Parmi les patients présentant des mutations de faible résistance à l’abondance, seul <& gt; mutation détectée dans le tableau du compartiment plasmatique Prévalence de la résistance dans l'ADN proviral Cinquante échantillons PBMC% étaient disponibles pour analyses par le test VIH-SNaPhot Nous avons trouvé que% de patients avaient des mutations de résistance détectables dans l'ADN proviral La mutation prédominante était encore TY / F / [ %], suivie de KN / [%] En outre, nous avons observé KR chez les patients et MV dans la table des patients Les données obtenues de toutes les mesures ont montré que les mutations NRTI, et pour le plasma ViroSeq, le plasma SNaPhot et les PBMC SNaPhot ont été trouvées plus souvent que les mutations NNRTI, et pour le plasma ViroSeq, le plasma SNaPhot et les PBMCs SNaPhotS dans la charge virale Au total,% des patients avaient débuté un traitement avant février De ces mutations, portaient des mutations de résistance; porteurs de mutations qui n'étaient pas pertinentes pour le régime prescrit et ont été placés dans le groupe de susceptibilité, et ont porté des mutations qui ont potentiellement affecté leur traitement et ont été placés dans le groupe de résistance faible ou élevé. Les INTI les plus fréquemment utilisés étaient la zidovudine, la lamivudine et l'abacavir, alors que les INNTI étaient toujours l'éfavirenz. Les mutations détectées uniquement par le test SNaPshot sensible étaient les suivantes: TY / F, MV et KN For patients, et , les résultats du génotype initial ont montré des mutations de résistance élevées contre la lamivudine, mais cela n'avait pas été pris en compte lors du choix du traitement de première intention. Dans ces cas, le délai moyen pour atteindre une charge virale plasmatique de & lt; copies / mL était l'écart-type jours [SD], jours Quatre patients,,, et portaient des mutations de résistance de haut niveau vers l'éfavirenz, et ce groupe avait un temps moyen pour atteindre une charge virale plasmatique de & lt; copies / mL de jours SD, jours Cinq patients ont porté des mutations de résistance de haut niveau contre la zidovudine, et le temps moyen pour atteindre une charge virale plasmatique de & lt; Le nombre de copies / mL dans ce groupe était de jours SD, jours Seul le patient qui avait commencé le traitement était porteur de & gt; mutations de résistance primaire aux médicaments Ces mutations n'ont pas été détectées par le test de génotypage standard de base, et le traitement incluant l'abacavir, la lamivudine et l'éfavirenz a été initié. La charge virale plasmatique a diminué lentement au cours des mois suivants. un nouveau test de résistance a été effectué, et la présence des mutations KN et MV a été détectée. Par la suite, le traitement a été remplacé par l'abacavir, la zidovudine et le lopinavir boosté, suivi d'une forte baisse de la charge virale plasmatique & gt; log copies / mL en mois Lorsque l'analyse SNaPshot a été réalisée, ces mutations ont été trouvées dans l'échantillon de base; cela plaide en faveur de la présence de TDR de faible abondance qui, rétrospectivement, a entraîné un échec virologique précoce du traitement. Lorsque les groupes ont été comparés en ce qui concerne le TDR et la réponse au traitement, nous n'avons trouvé aucune différence significative calculs biliaires. charge de & lt; copies / ml dans les groupes au moyen d’une courbe de Kaplan-Meier Figure et trouvé aucune différence significative entre les groupes P =; Méthode de Gehan-Breslow-Wilcoxon Nous avons ensuite analysé la différence entre les groupes en termes de l’augmentation du nombre de cellules CD après l’année de traitement; nous n’avons trouvé aucune différence significative P = pour l’augmentation moyenne du nombre de cellules CD chez les patients qui étaient sensibles ou qui présentaient une résistance faible ou élevée au traitement antirétroviral Figure

Figure Vue largeTélécharger la courbe de Kaplan-Meier illustrant le délai de suppression virale chez les patients recevant un traitement Les patients ont été divisés en groupes sur la base des mutations de résistance aux médicaments détectées et de leur pertinence pour le traitement initié selon l’algorithme de Stanford. la résistance au niveau du sol a été regroupée en raison du petit nombre d’observations dans le groupe de résistance de bas niveau n = Il n’y avait pas de différence significative dans la baisse de la charge virale lorsqu’on extrapole aux médicaments administrés aux patients P =; Modèle à risques proportionnels de Cox Ceci indique que les patients porteurs de mutations de résistance et recevant un traitement médicamenteux ne cessent pas de supprimer la virémie dans les deux premières années après le début du traitement. Cependant, il pourrait y avoir un effet aux stades ultérieurs comme niveau de résistance accumule, ce qui a été indiqué pour certains des patients qui ont eu des mutations de résistance de haut niveau telles que MV, KN et YCFigure Vue largeTélécharger une courbeKaplan-Meier illustrant le temps de suppression virale chez les patients recevant un traitement Les patients ont été divisés en groupes mutations de résistance aux médicaments détectées et leur pertinence pour le traitement initié selon l’algorithme de résistance au VIH de Stanford Les patients présentant une résistance faible et élevée ont été regroupés en raison du faible nombre d’observations dans le groupe de résistance de bas niveau n = Il n’y avait pas de différence dans la baisse de la charge virale extrapolée aux médicaments administrés tients P =; Modèle à risques proportionnels de Cox Ceci indique que les patients porteurs de mutations de résistance et recevant un traitement médicamenteux ne cessent pas de supprimer la virémie dans les deux premières années après le début du traitement. Cependant, il pourrait y avoir un effet aux stades ultérieurs comme niveau de résistance accumule, ce qui a été indiqué pour certains des patients qui ont eu des mutations de résistance de haut niveau tels que MV, KN et YC

Figure Vue largeTélécharger la diapositive Comparaison des données cliniques entre les groupes Les patients sensibles au traitement sont représentés par des points noirs, ceux présentant une faible résistance sont représentés par des carrés gris, et ceux présentant une résistance élevée sont représentés par des losanges noirs A, Time to charge virale indétectable L’analyse par le test U de Mann-Whitney a montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les groupes B. Augmentation du nombre de cellules CD après l’année de traitement L’analyse par le test U de Mann-Whitney a montré qu’il n’y avait pas de différence significative View largeTélécharger la diapositive Comparaison des données cliniques entre les groupes Les patients sensibles au traitement sont représentés par des points noirs, ceux présentant une faible résistance sont représentés par des carrés gris et ceux présentant une résistance élevée sont représentés par des losanges noirs A, Temps indétectable charge virale L’analyse par le test U de Mann-Whitney a montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre Groupes B, Augmentation du nombre de cellules CD après l’année de traitement L’analyse par le test U de Mann-Whitney a montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les groupes.

Discussion

comme un compartiment précieux pour l’analyse de résistance Chez les patients, nous avons seulement pu détecter des mutations provenant des échantillons de PBMC, certaines étant des mutations de résistance de haut niveau. Cependant, le nombre de mutations dans le PBMC ne dépassait pas le nombre dans le compartiment plasmatique, mais comme prévu, l’inclusion des deux a renforcé l’interprétation globale du niveau de résistance aux médicaments, ce qui est en accord avec les observations précédentes Ainsi, les différentes observations dans le compartiment plasmatique et PBMC sont probablement attribuées aux effets stochastiques. que la détection de variants minoritaires est à la limite de la détection de la sensibilité. La présence de résistance au VIH-NRTI ou NNRTI avant traitement antirétroviral peut conduire à une réponse sous-optimale Cependant, nos résultats ne montrent aucune différence significative dans la suppression virale. compter l’augmentation entre le groupe de susceptibilité et le groupe de résistance faible ou élevé portant des mutations NRTI et / ou NNRTI lorsque Cependant, une tendance vers une suppression plus faible de la virémie a été observée chez les patients qui ont porté & gt; En comparaison, Johnson et al ont récemment étudié la présence de mutations de résistance de faible abondance au moyen d’une méthode de PCR allèle-spécifique hautement sensible et ont détecté différentes mutations de résistance dans une large cohorte de patients naïfs avec des nouveaux diagnostics. des mutations de faible abondance étaient significativement associées à un échec virologique Une autre étude a abordé des questions similaires en utilisant la technique de séquençage ultradeep et n’a trouvé aucune différence significative pour le temps de l’échec virologique lorsque les cohortes entières de patients avec et sans mutations de faible abondance ont été comparées sans tenir compte de la susceptibilité du traitement de première ligne . Cependant, lorsque les résultats ont été stratifiés chez les patients atteints de TDR potentiellement affectant les schémas thérapeutiques individuels, ils ont trouvé que les patients Mutations de résistance aux INNTI dans une stratégie NNRTI Les patients présentant un INTI ou un INNTI ont été regroupés et comparés à des patients sans mutation Le paramètre virologique clinique utilisé ici, c’est-à-dire, le délai avant viral la suppression n’est pas directement comparable à une défaillance virologique définie comme une charge virale détectable après des mois de traitement; ainsi, nos données doivent être comparées avec prudence aux études mentionnées ci-dessus. Bien que nos résultats impliquent que les TDR de faible abondance ne doivent pas être pris en compte lors de la signature des schémas thérapeutiques de première intention, ils doivent être interprétés avec prudence. Notre étude reposait sur une large méthode de détection multiplex à haute sensibilité; Les résultats divergents de cette étude soutiennent les observations de Kearney et al , Peuchant et al et Metzner et al tout en s’opposant aux études discutées ci-dessus, mais plus encore. surtout, ils soulèvent la possibilité que des mutations de résistance à faible abondance chez un receveur puissent représenter une accumulation aléatoire de mutations plutôt qu’une sélection de mutations transmises par traitement, ce qui est confirmé par le fait qu’elles ne semblent pas avoir d’importance dans la présente étude. cette étude est limitée par le nombre de patients présentant des mutations de résistance de faible ou de haut niveau, ce qui rend difficile l’établissement d’une différence significative malgré le fait qu’une tendance vers un niveau plus élevé de complications cliniques dans le groupe de résistance était Une autre caractéristique importante est que la moitié des patients du groupe de résistance faible ou élevée ont été traités avec des INTI en même temps qu’un inhibiteur de la protéase. Par conséquent, le risque d’échec viral devrait être plus faible en présence d’un inhibiteur de la protéase, protégeant ainsi l’effet clinique des mutations de résistance aux INTI ou aux INNTI. Les résultats de cette étude justifier d’autres études, principalement une étude randomisée où le traitement est guidé par le profil de résistance déterminé par le test de génotypage ViroSeq avec ou sans information de la méthode SNaPhotS Une telle étude permettrait de déterminer plus directement si la présence et le pourcentage de TDR jouent un rôle Pour conclure, nous constatons que la résistance chez les patients naïfs et récemment infectés peut passer inaperçue lorsque le séquençage populationnel est utilisé. En comparant les résultats des méthodes de génotypage SNaPhot sensible et standard ViroSeq, nous avons détecté une prévalence plus élevée de Cependant, nos résultats n’appuient pas l’hypothèse selon laquelle la p La résence de mutations TDR minoritaires chez des patients récemment infectés a des implications cliniques en termes d’échec virologique précoce

Remerciements

Nous remercions Jonna Guldberg et Erik Hagen Nielsen pour leur excellente assistance technique. Nous remercions également le groupe de projet SERO et le soutien technique du Statens Serum Institut pour son aide dans la collecte d’échantillons de sang et l’extraction d’ADN. fondation, la Fondation Scandinavian pour la chimiothérapie antimicrobienne, et la Fondation Augustinus MRJ est le récipiendaire de la bourse de recherche danoise Alfred Benzon Foundation PRG est le récipiendaire d’un Conseil national australien de recherche médicale et médicale Prix de développement de carrière biomédicalePerspectives d’intérêts potentiels Tous les auteurs: non conflits