Structure – Etudes de la relation d’activité des inhibiteurs de l’oligonucléotide intégrase du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent responsable de l’immunodéficience acquise syndrome du sida (SIDA), qui reste un problème de santé publique mondial qui justifie la recherche constante de nouveaux inhibiteurs de la réplication du VIH. Les traitements actuels généralement appelés traitements antirétroviraux hautement actifs (HAART) combinent plusieurs médicaments actifs qui ciblent une ou plusieurs étapes clés du cycle de vie du VIH. Jusqu’à récemment, la multithérapie comprenait une combinaison d’inhibiteurs de protéase, d’inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et d’inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse.1 En 2003, un inhibiteur de la fusion virale avec la membrane cellulaire, l’enfuvirtide 2, a été ajouté à la pharmacopée. Des progrès récents ont été réalisés dans deux directions: d’abord, la conception de ligands corécepteurs CCR5 tels que Maraviroc qui entrave l’entrée virale et, le second, le développement d’inhibiteurs de la troisième enzyme virale, l’intégrase (IN) .3HIV-1 IN est un virus viral 32 kDa protéine qui catalyse une insertion covalente d’ADN viral produite par transcription inverse de l’ARN génomique viral dans les chromosomes des cellules infectées.Une fois intégré, le provirus persiste dans la cellule hôte et sert de modèle pour la transcription des gènes viraux et la réplication du génome viral, conduisant à la production de nouveaux virus. Plusieurs inhibiteurs spécifiques de l’étape d’intégration, y compris le raltégravir, l’elvitégravir et le S / GSK1349572, se sont avérés très prometteurs, assurant une reconnaissance rapide des inhibiteurs de l’IN (INI) en tant que nouvelle classe importante de médicaments antirétroviraux. Cependant, comme avec d’autres médicaments antirétroviraux, la résistance aux INI a émergé à la fois in vitro et chez les patients ne répondant pas au traitement, justifiant la recherche de nouveaux inhibiteurs. L’ADN viral est inséré dans l’ADN de la cellule hôte dans une série d’étapes distinctes.4 Après la transcription inverse du génome viral, l’IN lie les deux extrémités de l’ADN viral, formant un complexe nucléoprotéique constituant le noyau du complexe de pré-intégration. (PIC). Au sein du PIC, l’IN catalyse le traitement en clivant les dinucléotides terminaux des deux extrémités de l’ADN viral. Une fois que le PIC a migré dans le noyau de la cellule infectée, l’IN intervient dans une réaction de transfert de brin dans laquelle l’ADN viral est inséré dans l’ADN de la cellule hôte. Ainsi, dans les cellules infectées, l’IN reste associé à l’ADN viral depuis sa synthèse jusqu’à son insertion dans le génome cellulaire. Ce complexe IN / ADN s’est avéré être la cible la plus pertinente pour les inhibiteurs de l’IN, comme le démontre la puissance des inhibiteurs spécifiques du transfert de brin. Plus haut, nous avons montré que les oligonucléotides 11-mères conjugués aux molécules hydrophobes inhibent l’activité catalytique du VIH recombinant. 1 IN.8,9 Ces composés peuvent être considérés comme des inhibiteurs prometteurs de l’IN en raison de leur capacité à interagir avec le complexe IN et à le rompre avec l’ADN.8 Pour évaluer le rôle du fragment hydrophobe, nous avons testé l’activité inhibitrice de l’oligonucléotide GGTTTTTGTGT (11D) conjugué avec des molécules telles que l’acridine8 ou les xanthènes [fluorescéine, tétraméthylrhodamine (TAMRA) et éosine] ainsi que le cholestérol, le thiochrome et l’acide oléique (Ole) .9 Les conjugués avec les xanthènes se sont révélés être les inhibiteurs les plus actifs. En outre, le remplacement de la fluorescéine par l’éosine (tétrabromofluorescéine) a entraîné une augmentation de 6 fois de l’effet inhibiteur, démontrant ainsi l’importance des substituants dans les xanthènes. Il est intéressant de noter que les pyranodipyrimidines ayant un échafaudage similaire aux xanthènes étaient des inhibiteurs d’intégration efficaces.10 Bien que la séquence oligonucléotidique des conjugués ait une influence limitée sur leur action, le raccourcissement de la longueur des oligonucléotides a entraîné une forte diminution de leur activité inhibitrice.9 Au total, ces résultats ont montré que les deux parties des conjugués influencent fortement leur effet inhibiteur. Il est à noter que l’activité anti-IN a également été trouvée pour des conjugués de divers dinucléotides et intercalants modifiés, la puissance d’inhibition dépendant également des deux parties des composés.11 Dans cette étude, nous avons effectué des modifications étape par étape des deux oligonucléotides et des parties hydrophobes des conjugués oligonucléotidiques et testé l’influence de ces modifications sur l’effet inhibiteur. Cette analyse de structure et de relation d’activité (SAR) visait à déterminer les caractéristiques structurales des conjugués responsables de l’inhibition de l’IN pour optimiser la structure de l’inhibiteur et la méthode de sa synthèse.Comme indiqué précédemment, 8 la liaison des conjugués à le complexe IN / ADN et sa perturbation subséquente entraînent une forte inhibition du traitement 3 &#x02032 ;. Ainsi, la puissance des conjugués a été surveillée en quantifiant leur capacité à inhiber cette réaction. Nous avons montré plus haut que l’activité inhibitrice des conjugués oligonucléotidiques ne dépend pas de la fixation de la fraction hydrophobe sur le 3 ′ – ou du 5 ′ -end.9 Néanmoins, choisir une méthode optimale pour la molécule hydrophobe attachement à l’oligonucléotide 11D, nous avons étudié l’influence de la liaison entre l’éosine et la fluorescéine et 11D sur l’activité inhibitrice conjuguée (figure ​ (figure1) .1). L’éosine a été attachée à l’extrémité 3D de 11D soit par l’intermédiaire d’un lieur flexible (11D-E) soit directement au groupe 2-amino dans le nucleoside terminal (11D-E2). La fluorescéine a été attachée au 5 ′ -end semblable à l’éosine (FAM2-11D) ou à travers un fragment plus long et rigide d’hydroxyprolinol (FAM1-11D). Les conjugués contenant la même fraction hydrophobe ont montré une activité inhibitrice comparable; IC50 était d’environ 50 nM pour 11D-E et 11D-E2 et 300 nM pour 11D-FITC, FAM1-11D et FAM2-11D. Par conséquent, la structure de la liaison entre les deux parties des conjugués n’affecte pas leur capacité à inhiber le VIH-1 IN.Figure 1Structures de résidus conjugués à 2 ′ -deoxy- (11D) et 2 ′ -O-méthyle – (11M) oligonucléotides.La synthèse de l’inhibiteur 11D-E le plus efficace est plutôt laborieuse et fastidieuse, interférant ainsi avec son développement ultérieur pour un usage pharmacologique. L’éosine est détruite lors de la déprotection des oligonucléotides dans des conditions basiques, et par conséquent, elle ne peut pas être couplée à des oligonucléotides pendant la synthèse automatique. Par conséquent, une étape supplémentaire de couplage de l’éosine aux oligonucléotides de 3 ′ -amino suivie d’une purification par HPLC est obligatoire pour la synthèse du conjugué. Pour éviter cette étape supplémentaire, nous avons remplacé l’éosine par un ensemble de xanthènes qui peuvent être facilement attachés aux oligonucléotides pendant la synthèse automatique (Figure 1), puis testé la capacité de ces nouveaux conjugués à inhiber l’IN. Du fait que le mode de la molécule hydrophobe et la jonction de 11D n’affectent pas l’activité anti-IN, nous avons utilisé des agents de modification correspondants pour simplifier la synthèse et la purification du conjugué. Ainsi, la plupart des composés ont été attachés à l’extrémité 5 ‘de 11D. Les DAS de ces nouveaux composés ont été étudiés en couplant des dérivés de xanthène avec différents substituants tels que la 6-carboxyfluorescéine (FAM), le 6-carboxy-4,7,2 ′, 7 ′ -tétrachlorofluorescéine (TET), le 6-carboxy -4,7,2 ′, 4 ′, 5 ′, 7 ′ -hexachlorofluorescéine (HEX), 2,4,5,7-tétrachloro-3,6-dihydroxy-9- (2 ′ 5 ′ -dichloro-4 ′, 6 ′ -dicarboxyphényl) acridine (HEXAcr), 12 et 4 ′, 5 ′ -dichloro-2 ′, 7 &#x02032 ; -diméthoxyfluorescéine (JOE) à 11D (Figure ​ (Figure1) .1). De plus, des conjugués contenant de l’acide oléique (Ole) ont été synthétisés en utilisant un support de CPG avec de l’acide oléique attaché.9 Tous ces conjugués ont été testés pour leur capacité à inhiber l’activité catalytique IN dans le traitement et comparé à le conjugué contenant de l’éosine (tableau 1). La substitution complète du brome par du chlore sur le fragment du triple anneau n’a eu aucune influence sur l’activité inhibitrice du conjugué. En effet, les conjugués avec HEX et HEXAcr ont montré la même puissance inhibitrice que le composé 11D-E. Une modification du fragment triple anneau résultant de la substitution de l’oxygène par l’azote (HEX-11D → HEXAcr-11D) n’a pas affecté l’activité inhibitrice. Les composés contenant du TET et du JOE ont montré une diminution de 6 fois de l’inhibition du traitement à l’aide du composé 11D-E et ont démontré la même capacité à inhiber l’IN que le FAM-11D. Par conséquent, la présence de deux atomes de chlore n’est pas suffisante pour améliorer la puissance inhibitrice. De plus, nous pouvons conclure que la localisation des atomes de chlore n’a aucune influence sur l’inhibition de l’IN; seul le nombre d’atomes d’halogène sur le fragment du triple anneau est important. En poursuivant les études SAR des groupes hydrophobes, nous avons étudié des conjugués de l’oligonucléotide 11D avec deux molécules hydrophobes. La présence simultanée de fluorescéine et d’acide oléique dans les conjugués a significativement amélioré leur activité inhibitrice par rapport aux composés monosubstitués (tableau 1, comparer les composés FAM-11D-Ole et 11D-FAM-Ole avec FAM-11D et 11D-Ole). Cet effet, qui ne dépend pas de la localisation de la fluorescéine, pourrait résulter d’une hydrophobicité accrue des composés bisubstitués. Tableau 1 Effet des résidus hydrophobes conjugués sur l’oligonucléotide GGTTTTTGTGT sur l’inhibition du traitement par le conjuguéNous avons déjà montré que le raccourcissement de la partie oligonucléotidique dans les conjugués contenant FITC réduit leur activité inhibitrice.10 Ici, nous avons synthétisé des conjugués d’éosine avec des oligodésoxynucléotides GG (T) n, où n = 8 et testé leur effet inhibiteur. Un conjugué du 10-mère s’est avéré être deux fois moins efficace que le composé 11-mère, tandis que des conjugués d’oligonucléotides plus longs ont montré à peu près le même niveau d’inhibition du traitement (figure 2) (figure 2). ). On peut donc conclure que les oligonucléotides 11-mères ont la longueur optimale pour agir comme inhibiteur efficace. Figure 2Effet de la longueur des oligonucléotides sur l’activité anti-IN des oligodésoxynucléotides GG (T) n 3 ′ -liés à l’éosine.A la diminution de la puissance inhibitrice du conjugué résultant du raccourcissement oligonucléotidique ainsi qu’un faible effet de la séquence oligonucléotidique sur l’activité inhibitrice10 nous ont permis de supposer que le rôle principal du fragment oligonucléotidique repose sur les contacts électrostatiques avec les résidus Lys et Arg de IN. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons changé la charge oligonucléotidique sans modifier sa longueur en remplaçant les groupes phosphodiester par des méthylphosphonates (figure ​ (figure3) .3). Trois conjugués ont été synthétisés contenant trois méthylphosphonates à des positions différentes: près de 3 ′ -end, près de 5 ′ -end, et uniformément répartis le long de la chaîne oligonucléotidique (Tableau 2, composés 11DX-E). Tous les conjugués ont inhibé IN environ 2 fois moins efficacement que 11D-E.Ainsi, l’élimination de trois charges négatives a produit le même effet que l’élimination d’un nucléotide portant une charge négative (figure ​ (figure2) .2). Ceci indique que la quantité totale de nucleotides, mais pas seulement la charge, est importante pour l’activité inhibitrice. De plus, la même activité des conjugués 11DX-E-1, 11DX-E-2 et 11DX-E-3 montre que la distribution de charge négative n’est pas importante pour les interactions avec IN. De plus, nous avons remplacé tout ou partie des groupes phosphodiester par des phosphorothioates (Figure ​ (Figure3) 3) et constaté que cette modification améliorait l’activité inhibitrice (Tableau 2). Cela pourrait s’expliquer à la fois par la localisation accrue de la charge négative sur les atomes de soufre par rapport aux oxygènes dans les phosphodiesters et par les propriétés hydrophobes plus élevées des phosphorothiates que par celles des phosphodiesters. De même que pour la modification du méthylphosphonate, la localisation des phosphorothioates le long de la chaîne oligonucléotidique n’a eu aucun effet sur l’inhibition de l’IN. De plus, la substitution partielle ou totale de phosphodiester par des phosphorothioates conduit aux mêmes valeurs de CI50 (tableau 2). Figure 3 Modifications du squelette phosphate et sucre. Tableau 2 Effet de la structure oligonucléotidique sur l’inhibition du 3 ′ traitement par le conjugué nous avons constaté que le raccourcissement des oligonucléotides diminuait significativement la puissance inhibitrice des conjugués, nous avons poursuivi les études SAR de la structure des oligonucléotides pour déterminer le rôle des bases hétérocycliques. Une série de conjugués HEX contenant du 1,2-didésoxyribose (ddR) ou du 1,3-propanediol (PD) au lieu de 10 ou 6 nucleosides natifs a été synthétisée (tableau 2). Ces composés avaient le même nombre de phosphates que HEX-11D et, dans le cas de la modification du 1,2-didésoxyribose, les conjugués conservaient la même longueur et la même structure rigide que le squelette phosphaté du sucre. Les composés contenant du 1,3-propanediol ont une structure flexible. L’absence de bases hétérocycliques réduit significativement l’activité inhibitrice des conjugués (tableau 2). La substitution de six nucléotides à la fois par le 1,2-didésoxyribose et le 1,3-propanediol a entraîné une augmentation de la CI50 de 6 fois, alors que l’absence de 10 bases a conduit à une augmentation de 24 fois de la CI50. De manière similaire aux modifications des internucléotides phosphates décrits ci-dessus, il n’y avait pas de corrélation entre l’activité anti-IN et la localisation des résidus modifiés dans l’oligonucléotide; les composés HEX-11D-ddR-1 et HEX-11D-ddR-2 ainsi que HEX-11D-PD-1 et HEX-11D-PD-2 ont démontré approximativement le même effet (tableau 2). Ainsi, la présence de bases hétérocycliques est obligatoire pour l’inhibition efficace de l’activité IN. Ils pourraient être impliqués dans des interactions avec des acides aminés chargés positivement, qui sont favorisés par l’accessibilité de base dans l’oligonucléotide simple brin. Il est intéressant de noter que Arg et Lys peuvent être impliqués dans des contacts avec toutes les bases nucléotidiques13, ce qui peut expliquer pourquoi l’inhibition de l’IN par les conjugués oligonucléotidiques n’est pas spécifique à la séquence.2 ′ -O-Methylation est largement utilisée pour augmenter la résistance des oligonucléotides aux nucléases dans des expériences cellulaires ultérieures. Les deux dérivés de l’éosine (11M-E) et de l’hexadécimal (HEX-11M) de l’oligonucléotide 2OMO ont montré une activité inhibitrice identique à celle des variants 2deoxy (tableau 2), nous les avons donc utilisés dans d’autres études.Encouragé par la puissance améliorée des conjugués contenant des phosphorothioates et des composés bisubstitués, nous avons synthétisé un conjugué de 2-O-méthyl-oligonucléotide GGUUUUUGUGU contenant toutes les liaisons internucléotidiques phosphorothioate (11MS) avec HEX au 5 ′ -end (HEX- 11MS) et un autre avec de l’acide 3-oléique supplémentaire (HEX-11MS-Ole) (figure ​ (figure 4A) .4A). L’inhibition du traitement par HEX-11MS-Ole dans le test typique est montrée à la figure ​ De façon surprenante, l’activité inhibitrice des deux composés était comparable (tableau 2). Ainsi, la fixation de l’acide oléique à l’inhibiteur efficace HEX-11MS n’a pas encore amélioré son activité, tandis que sa fixation à un inhibiteur médiocre FAM-11D (IC50 d’environ 300 nM) a fourni plus de 10 fois une amélioration du traitement de 3 ′ activité inhibitrice (Tableau 2, FAM-11D-Ole). De même, le remplacement de tous les phosphodiester internucléotidiques par des phosphorothioates (composé 11DS-E-1) n’augmente pas de manière supplémentaire la puissance inhibitrice par rapport aux conjugués contenant seulement 3 phosphorothioates (Tableau 2). Il est à noter que la CI50 pour le meilleur de nos inhibiteurs n’est pas inférieure à 20 nM. Considérant le fait qu’il faut un dimère IN pour accomplir un traitement et que la concentration en IN utilisée est d’environ 50 nM, on peut supposer que la concentration des dimères IN catalytiquement actifs ne dépasse pas 20 ′ 25 nM et correspond donc à IC50 pour le meilleur de nos inhibiteurs.Cela nous permet d’émettre l’hypothèse que, pour être actif, le conjugué doit lier toutes les sous-unités de l’IN pour empêcher leurs interactions avec l’ADN du substrat.Figure 4HEX-11MS-Ole – un inhibiteur principal de l’intégrase du VIH-1. (A) Structure de HEX-11MS-Ole. (B) Dépendance de l’efficacité relative du traitement 3 ′ sur les concentrations de HEX-11MS-Ole. L’efficacité de réaction en l’absence de l’inhibiteur est considérée … En conclusion, nos études SAR de conjugués d’oligonucléotides avec des molécules hydrophobes indiquent que (1) l’éosine peut être remplacée par HEX puisque les conjugués contenant HEX montrent la même activité anti-IN, tandis que leur synthèse est plus pratique et efficace; (2) les oligonucléotides de phosphorothioate sont favorisés pour la préparation de conjugués en raison de leur activité inhibitrice accrue et de leur plus grande stabilité vis-à-vis des nucléases cellulaires; (3) les deux phosphates internucléotidiques et les bases nucléiques sont nécessaires; et (4) une fixation supplémentaire de l’acide oléique sur les phosphorothioates contenant HEX n’améliore pas leur activité inhibitrice mais pourrait être utile pour améliorer leur pénétration cellulaire, leur distribution et leur stabilité aux nucléases.