Limites des tests diagnostiques rapides chez les patients atteints de paludisme présumé: Une évaluation de l’exactitude diagnostique du Swaziland, un pays à faible endémicité visant l’élimination du paludisme

ContexteLa performance des tests de diagnostic rapide basés sur des protéines riches en histidine spécifiques de Plasmodium falciparum n’a pas été bien caractérisée pour l’évaluation des cas suspects de paludisme dans des contextes de faible endémicitéMéthodesUtilisation d’échantillons de sang séché provenant de patients suspectés de paludisme dans des établissements de santé de faible endémicité Nous avons étudié la précision diagnostique des TDR basés sur les protéines riches en histidine en utilisant une réaction en chaîne de la polymérase qualitative PCR PCR nichée ciblant le gène du cytochrome b et la PCR quantitative comme étalons de référence Pour explorer les raisons des résultats faux négatifs et / ou faux positifs , nous avons utilisé la PCR spécifique à pfhrp / et les analyses de régression logistique des facteurs épidémiologiques potentiellement associésRésultats De patients,% de n = RDT-positifs et% d’échantillons RDT-négatifs n = étaient disponibles et sélectionnés pour les tests Comparaison avec PCR nested, sensibilité, spécificité , valeur prédictive positive PPV, et valeur prédictive négative NPV de Les TDR étaient%,%,% et%, respectivement. Après exclusion des échantillons avec des densités parasitaires

paludisme, test de diagnostic rapide, précision diagnostique, transmission faible, infection subpatente entre et, le taux d’incidence mondiale du paludisme a chuté de% La plupart de ces succès ont été attribués à un meilleur contrôle des vecteurs, à la thérapeutique et au diagnostic. Les TDR, qui sont des tests basés sur la chromatographie d’immunité détectant les antigènes du paludisme, tels que la protéine riche en histidine spécifique de Plasmodium falciparum HRP- [, -] TDR ont révolutionné le diagnostic du paludisme Le diagnostic précis du paludisme est essentiel pour une bonne gestion des patients et une surveillance au niveau de la population. Études précoces de P falciparum Les performances des TDR basés sur HRP provenaient principalement de paramètres de transmission modérés et évalence par amplification en chaîne par polymérase PCR, ≥% et sensibilité et spécificité de% -% et% -%, respectivement Cependant, l’épidémiologie changeante du paludisme dans les milieux à faible transmission présente de nouveaux défis pour le diagnostic. des infections asymptomatiques sont sous-patentes, ce qui signifie en dessous de la limite de détection fiable des TDR et de la microscopie, qui est une densité parasitaire – / μL Il est bien établi que pour la détection active des infections asymptomatiques, les TDR Les cas d’infection symptomatique à P. falciparum sont probables, car l’immunité peut être plus faible dans les milieux à faible transmission, entraînant des taux élevés de parasitémie à la présentation. possible qu’avec une diminution de l’immunité, les sujets peuvent devenir symptomatiques à des densités parasitaires plus faibles et échapper ainsi à la détection par TDR L’exactitude diagnostique des TDR peut inclure l’incapacité de supporter des conditions de terrain (température et humidité élevées, présence de suppressions de HRP dans certaines populations) et des erreurs de l’utilisateur, en particulier dans les situations où les cas de paludisme sont rares et ,], Notre étude concerne l’utilisation des TDR chez les patients se présentant dans des établissements de santé soupçonnés de paludisme dans le cadre de transmission faible du Swaziland Les TDR ont été introduits dans tous les établissements de santé au niveau national, et peu de temps après, un programme assurance qualité a été établi. Nous avons étudié la précision diagnostique des TDR en utilisant la PCR qualitative et quantitative en tant que standard de référence, et utilisé des modèles de régression logistique pour explorer le potentiel de la région de Lubombo. facteurs associés à la performance des TDR

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Étudier le design

Nous avons mené une étude observationnelle prospective sur la population de la précision du diagnostic

Site d’étude

Le Swaziland est un pays à faible revenu moyen en Afrique australe C’est un milieu à faible transmission avec une incidence du paludisme de – par la population à risque et une prévalence de l’infection palustre mesurée pour la dernière fois en% en entre janvier et avril Les cas acquis localement surviennent principalement dans les zones rurales de l’est du pays et environ la moitié des cas sont importés, principalement du Mozambique voisin. Le paludisme à P. falciparum est la principale espèce et le principal vecteur de maladie, Anopheles arabiensis, est à l’intérieur mordre et se reposer

Population étudiée

La population étudiée comprenait des patients atteints de paludisme symptomatique détecté par RDT dans tous les établissements de santé de la région orientale de Lubombo entre août et avril, ainsi que ceux suspectés de paludisme testés. Les sujets négatifs ont été exclus uniquement si un échantillon de DBS était insuffisant. imbibé de dos ou manquant

Collecte de données

Des tests spécifiques au P falciparum ont été réalisés avec le test de dépistage rapide de la maladie de First Response Malaria Ag P falciparium Premier Medical selon les instructions du fabricant Différents lots de TDR utilisés dans l’étude ont été testés dans un laboratoire international qualifié de l’Organisation Mondiale de la Santé avant l’arrivée Au Sri Lanka, du sang a été simultanément recueilli sur du papier filtre Whatman, séché pendant la nuit et stocké dans des sacs en plastique scellés avec un dessiccant. Des tests de TDR et des prélèvements DBS ont été effectués chaque année par le Programme National de Lutte contre le Paludisme. Les échantillons de DTS et de DBS ont été collectés pour le contrôle de qualité tous les mois par des agents de surveillance et stockés dans des échantillons DBS ° C provenant de tous les échantillons positifs au RDT et un sous – ensemble d ‘échantillons négatifs ont été sélectionnés pour des critères de sélection. échantillons était% d’échantillons négatifs par centre de santé par mois, et échantillon par mois provenant d’établissements de santé ayant des échantillons négatifs au TDR Le nombre total d’échantillons négatifs au TDR collectés pour une installation donnée au cours d’un mois donné a été arrondi au dixième près et le% de ce nombre a été sélectionné au hasard pour analyse. Le Programme National de Lutte contre le Paludisme a tenté une visite de suivi avec tous les cas de paludisme en quelques heures pour mener une enquête sur des cas, incluant la collecte de données cliniques et épidémiologiques, y compris les coordonnées du système de positionnement global, historique de voyage Le programme d’AQ comprenait la collecte d’une lame pour chaque cas de TDR positif, mais ces données ont été omises en raison d’une coloration irrégulière fréquente.

Tests moléculaires

Des échantillons de DBS ont été transportés à l’Université de Californie, San Francisco UCSF, où l’ADN a été extrait en utilisant une méthode saponine / Chelex, comme décrit ailleurs Une méthode PCR nichée nichée ciblant le gène mitochondrial du cytochrome b a été utilisée comme étalon de référence. L’identification des espèces pour tous les échantillons positifs pour la nPCR a été réalisée à l’aide d’un digestat de restriction AluI Pour explorer la parasitémie de faible densité comme cause potentielle de résultats de TDR faux négatifs, nous avons mesuré les densités parasitaires de tous les échantillons nPCR en temps réel. PCR quantitative qPCR ciblant le transfert de Plasmodium gène ARN méthionine Des contrôles de densité connus ont été utilisés pour créer une courbe standard Cinq microlitres d’ADN matrice ont été utilisés dans une réaction de -μL avec les conditions de thermocyclage suivantes: ° C minutes, cycles de: ° C pour secondes, ° C pour secondes, et ° C pour minutePour explorer la suppression du gène pfhrp comme une raison potentielle pour les résultats de RDT faux-négatifs, nous avons utilisé DN extrait A à partir d’échantillons RDT-négatifs, nPCR-positifs avec des densités de parasites ≥ / μL pour amplifier les gènes pfhrp et pfhrp par des méthodes publiées ailleurs

Gestion des données et analyse

Les données RDT des établissements de santé ont été collectées sur papier puis entrées dans Microsoft Excel, fusionnées avec des données moléculaires, nettoyées et analysées à l’aide de la version logicielle Stata et les résultats PCR ont été comparés, et la précision diagnostique des TDR a été calculée en utilisant nPCR comme référence. Etant donné que la limite de détection connue des TDR était une densité parasitaire d’environ / μL, la précision diagnostique a également été calculée en excluant les échantillons de faible densité. Pour la sensibilité et la spécificité, la méthode Begg and Greens a été utilisée pour tenir compte du biais de vérification qui peut avoir résulté de l’échantillonnage d’une proportion d’échantillons négatifs au TDR Autres raisons potentielles du TDR faux-négatifs ou fausse positivité TDR du volume d’essais et du nombre d’échantillons TDR positifs par établissement de santé, transmission saison, et année de transmission ont été explorés au moyen de χ analyses pour les données catégoriques ou t tests pour les variables continues et mod de régression logistique Les covariables ont été incluses dans l’analyse multivariée si la relation dans l’analyse bivariée était significative.% CI excluant la dégradation potentielle de l’ADN due au traitement PCR retardé mesuré en jours depuis la collecte des échantillons aux tests PCR ainsi que les données démographiques, cliniques, comportementales et épidémiologiques obtenues. des études de cas ont été testés de manière similaire pour les associations avec la fausse positivité

Éthique

L’approbation éthique a été obtenue auprès de l’UCSF et du ministère de la Santé du Swaziland

RÉSULTATS

Recrutement

Un total de patients suspectés de paludisme ont été testés avec des TDR entre juin et avril dans les établissements de santé de la région de Lubombo. Figure 32% des échantillons ont été sélectionnés pour l’AQ Trente-quatre échantillons de DBS étaient manquants ou contenaient un échantillon inadéquat quantité de sang

Figure Vue largeDownload slideFlux de recrutement des participants au plan d’étude avec tests de diagnostic rapides TDR, PCR nichée nichée et résultats PCR quantitatifs Abréviation: PCR, réaction en chaîne de la polymérase; QA, assurance de la qualitéFigure View largeTélécharger la diapositiveFlow chart of study recrutement des participants avec tests de diagnostic rapide RDT, PCR nichée nichée et résultats de PCR quantitative Abréviation: PCR, réaction en chaîne de la polymérase; Assurance qualité, assurance qualité

Résultats qualitatifs de la PCR et de la qPCR

Parmi les patients positifs au TDR,% étaient positifs au nPCR; Parmi les patients négatifs au TDR,% étaient positifs nPCR Parmi les échantillons positifs au nPCR, ont été classés comme P falciparum Deux échantillons positifs RDT et nPCR ne pouvaient pas être spéciés. Les distributions des densités parasitaires déterminées par qPCR sont représentées sur la figure en% de PCR- La densité parasitaire était de – / μL en% et ≥ / μL en% Les infections subpatentes représentaient%,% et% d’échantillons avec des densités parasitaires. de & lt ;, -, et ≥ / μL, respectivement

Figure Vue largeDownload Densité parasite des échantillons PCR PCR positifs nichés et proportion de sous-brevet et brevet par catégorie de densité parasitaire Abréviation: PCR, amplification en chaîne par polymérase; RDT, test de diagnostic rapideFigure View largeDownload Densité parasite des échantillons ACP PCR positifs et proportion de sous-brevet et brevet par catégorie de densité parasitaire Abréviation: PCR, amplification en chaîne par polymérase; RDT, test de diagnostic rapide

Précision diagnostique des TDR avec nPCR comme référence

Tableau affichant tous les résultats RDT et nPCR n = ainsi que les résultats RDT et nPCR excluant les échantillons avec densité parasite & lt; / μL n = Les taux de faux positifs et faux négatifs étaient respectivement de% et de% La sensibilité des TDR avec nPCR utilisé comme étalon de référence était%% CI,% -%, comparé à%% -% après exclusion des échantillons avec une densité parasite & lt; / μL Tableau Valeur prédictive négative NPV améliorée de% à% lorsque les échantillons de faible densité étaient exclus les deux analyses, la spécificité était élevée, et la valeur prédictive positive PPV était faible

Tableau A Comparaison des résultats RDT et nPCR parmi tous les échantillons et excluant les infections à faible densité Échantillon Groupe nPCR Positif, Non nPCR Négatif, Non Total, Non Tous les échantillons RDT positif RDT négatif Total Excluant les échantillons avec densité parasitaire & lt; / μL RDT positif RDT négatif Total des échantillons du groupe nPCR positif, non nPCR Négatif, non total, non Tous les échantillons RDT positif RDT negativea Total Excluant les échantillons ayant une densité parasitaire & lt; / uL RDT positif RDT négatif negatif Total Abréviations: nPCR, réaction en chaîne par polymérase nichée; TDR, échantillons de testaRDT-négatifs à diagnostic rapide avec résultats nPCR représentaient% de tous les échantillons négatifs à la RDT sélectionnés pour l’assurance de la qualitéVoir Grand

Tableau Précision diagnostique des TDR utilisant le nPCR comme référence Référence TDR% CI,% Sensibilité Spécificité PPV NPV Tous les échantillons – – – – Excluant les échantillons avec densité parasite & lt; / μL – – – – TDR Valeur% CI,% Sensibilité Spécificité PPV NPV Tous les échantillons – – – – Excluant les échantillons ayant une densité parasitaire & lt; / μL – – – – Abréviations: IC, intervalle de confiance; nPCR, réaction en chaîne par polymérase nichée; NPV, valeur prédictive négative; PPV, valeur prédictive positive; RDT, test de diagnostic rapideVoir en grand

Absence de pfhrp et de pfhrp comme cause potentielle de résultats de TDR faux négatifs

Parmi les échantillons faussement négatifs RDT avec la densité parasite & gt; / μL médiane,; gamme – / μL, gène pfhrp amplifié dans tous les échantillons, et pfhrp amplifié dans tous sauf l’échantillon qui ne s’est pas non plus amplifié dans une région flanquée de pfhrp malp

Autres facteurs associés à la fausse-négativité ou à la fausse-positivité du RDT

Un total d’échantillons faussement négatifs ont été comparés à des échantillons vrais-négatifs en termes de volume de tests RDT et de nombre d’échantillons positifs pour RDT par établissement de santé, saison de transmission et année de transmission, et aucune association significative n’a été trouvée. échantillons n = ont été comparés à des échantillons faussement positifs n = en termes de volume de tests TDR et de nombre d’échantillons TDR positifs par établissement de santé, saison de transmission et année Tableau Dans l’analyse multivariée, seule – année de transmission vs année précédente, associé à un rapport de cotes corrigé de fausse positivité,; % CI, – Pour explorer la dégradation de l’ADN due au traitement PCR retardé comme cause potentielle d’une classification faussement positive incorrecte, les échantillons positifs au TDR / PCR négatif ont été comparés aux échantillons positifs au TDR / PCR, et le traitement de l’écart-type moyen Nous avons étudié l’âge, le sexe, la nationalité, la profession, le temps écoulé depuis le symptôme. début du traitement, gravité de la maladie, antécédents de paludisme dans l’année précédente, voyage à l’étranger ou au Swaziland au cours des dernières semaines, utilisation du moustiquaire, couverture par pulvérisation intradomiciliaire résiduelle, qualité du logement, distance à un plan d’eau et élévation et aucune de ces variables n’était significativement associée à des données faussement positives non montrées

TABLEAU Associations de mesure entre les facteurs épidémiologiques potentiels et les résultats variables de la positivité à la RDT, non% OU% CI aOR% CI Faux Positif = Vrai Positif n = Volume des tests des établissements de santé durant la période d’étude, Nombre de TDR ≤ Référence NA & gt; et ≤ – & gt; et ≤ – & gt; – Volume positif de l’établissement de santé, Nombre d’échantillons positifs pour le TDR pendant la période d’étude Référence NA – – – – – Saison de transmission Janvier – Avril Référence – Mai – Décembre – Année de transmission – Référence – – – Résultats variables, No% OU% CI aOR% CI Faux-Positif = Vrai-Positif n = Volume d’analyse de l’établissement de santé pendant la période d’étude, Nombre de TDR ≤ Référence NA & gt; et ≤ – & gt; et ≤ – & gt; – Volume positif des établissements de santé, Nombre d’échantillons positifs au TDR pendant la période d’étude Référence NA – – – – – Saison de transmission Janvier-avril Référence – Mai-décembre – Année de transmission – Référence – – – Abréviations: aOR, odds ratio ajusté; CI, intervalle de confiance; NA, non applicable; OU, odds ratio; RDT, test de diagnostic rapideVoir en grand

DISCUSSION

Chez les patients atteints d’une infection récente éliminée par immunité ou traitement, la raison la plus fréquente de résultats de TDD faussement positifs dans des contextes de transmission modérée et élevée, mais cette explication semble peu probable dans nos contextes de faible transmission. La positivité n’a pas été associée au diagnostic du paludisme au cours de l’année écoulée ou à d’autres indicateurs potentiels d’infection récente, tels que l’âge, le sexe, la profession, la nationalité mozambicaine, la durée des symptômes, les voyages récents et la La deuxième moitié de l’étude, mais pour des raisons imprécises Les cas plus nombreux pendant la deuxième année peuvent avoir conduit les agents de santé à surestimer les résultats du TDR comme positifs, ou d’autres problèmes d’erreur d’utilisation, de stockage ou de transport ] Une formation et une supervision améliorées, ainsi qu’un contrôle de la qualité, par exemple grâce à l’utilisation de puits de contrôle positifs, peuvent être nécessaires La qualité des produits de RDT semble être une cause moins probable, étant donné Contrairement à la plupart des études antérieures évaluant la précision diagnostique des TDR, nous n’avons pas pu utiliser la microscopie comme étalon de référence. Toutefois, en raison des limites de la microscopie, les méthodes moléculaires sont maintenant recommandées pour l’AQ de Les TDR , et notre analyse corrigée qPCR permettent la comparaison avec des études antérieures tout en validant les résultats de nPCR. La mesure des niveaux d’antigène HRP par rapport à l’ADN comme analyte plus comparable au TDR peut avoir été utile, mais ces méthodes n’ont pas ont été normalisés et n’auraient pas été faciles à réaliser dans le cadre d’un programme national d’assurance qualité. En sélectionnant des échantillons négatifs, nous avons peut-être sur- ou sous-sélectionné des échantillons faussement négatifs, mais nous avons ajusté les biais de vérification. tous les échantillons négatifs, mais il peut ne pas être possible de traiter un plus grand volume d’échantillons. Nous étions limités dans notre capacité à évaluer les raisons de la fausse positivité. Les données pourraient être améliorées en collectant des données détaillées sur le contrôle de la qualité, par exemple les conditions de stockage et de transport, l’étude qualitative des raisons du surdiagnostic et en intégrant les programmes d’assurance qualité et d’investigation des cas. l’incidence au Swaziland, il y avait peu d’échantillons positifs pour les TDR, et les IC pour les estimations de sensibilité étaient larges. Des études supplémentaires d’autres milieux de faible transmission devraient être poursuivies. Notre étude avait plusieurs points forts. années couvertes A notre connaissance, notre étude est la première à partir d’une prévalence parasitaire exclusivement à faible endémicité par PCR, &%; à utiliser la PCR pour évaluer la performance diagnostique des HRP-RDT chez les patients suspects de paludisme. qPCR et PCR ciblant pfhrp / gènes pour impliquer une infection de faible densité comme la principale raison de faible sensibilité De plus, nos résultats de faible sensibilité et de VPP ont des implications importantes pour la pratique clinique et la santé publique. Les diagnostics manqués ou retardés peuvent entraîner une progression de la maladie, des sous-estimations de la charge de morbidité et des occasions manquées de surveillance active. Notre étude a également des implications importantes pour les paramètres de faible transmission / élimination du paludisme Tout d’abord, une proportion plus élevée que prévu de cas suspects de paludisme étaient des% de faible densité, ce qui suggère que le paludisme clinique peut présenter à des densités parasitaires inférieures dans les milieux à transmission plus faible Le seuil pyrogène de densité parasitaire pour le paludisme à P. falciparum a été trouvé aussi bas que / μL . Ces infections peuvent aussi ne pas représenter la maladie primaire. de la parasitémie accidentelle de faible densité peut distraire de la prise en charge appropriée de Cependant, lorsque l’objectif est l’élimination du paludisme, toutes les infections peuvent transmettre les semences et justifier un traitement, et les agents de santé doivent être formés pour gérer un diagnostic différentiel plus nuancé et plus large des maladies fébriles. La PCR utilisant des échantillons de DBS est impraticable à des fins cliniques dans des contextes endémiques Des diagnostics plus sensibles au point de traitement sont en cours de développement L’Organisation Mondiale de la Santé n’a pas demandé leur utilisation en clinique, comme pour la détection d’infections asymptomatiques actives. surveillance , mais nos résultats suggèrent qu’ils peuvent être nécessaires dans des contextes de faible endémicité. Nous concluons qu’un diagnostic plus précis et plus précis sur le lieu de soins, ainsi qu’un contrôle de qualité et une assurance améliorés pour traiter le sur ou sous-diagnostic, sont nécessaires soutenir la gestion clinique des cas de paludisme et les efforts d’élimination plus larges au Swaziland, et potentiellement dans d’autres contextes de faible transmission s

Remarques

Remerciements Nous remercions Joe Novotny à la Clinton Health Access Initiative pour son soutien dans la coordination sur le terrain; Cebsile Shabalala, Sindi Dlamini et Maphalala Gugu au Laboratoire national de référence pour le soutien de laboratoire; Joe Vinetz de l’Université de Californie à San Diego et Dionica Gamboa de l’Universidad Peruana Cayetano Heredia pour avoir partagé les protocoles / pfhrp; Danica Helb à l’UCSF pour des conseils de laboratoire; Grant Dorsey, Kimberly Baltzell, Madhavi Dandu, Phil Rosenthal et Roly Gosling à l’UCSF pour leurs conseils; Theodoor Visser à l’Initiative d’accès à la santé Clinton pour son examen du manuscrit; le personnel de l’établissement de santé sur tous les sites; et les participants à l’étude Soutien financier Ce travail a été soutenu par le ministère de la Santé du Swaziland; la subvention de la Fondation Bill et Melinda Gates A; l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, les instituts nationaux de la santé accordent l’AI au M S H; Burroughs Wellcome Fund / Bourse de la Société américaine de médecine et d’hygiène tropicales A à M S H; la subvention du Fonds de la famille Horchow à M S H; et les boursiers de traduction de Gilead accordent RCE A à N Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués