L’expansion du spectre microbiologique des abcès cérébraux avec l’utilisation du séquençage de l’ADN ribosomal S multiple

Contexte L’abcès cérébral est couramment traité à l’aide d’antibiotiques prescrits empiriquement. Ainsi, une étude complète des organismes bactériens associés aux abcès cérébraux est essentielle pour définir le meilleur traitement empirique pour cette maladie potentiellement mortelle. Méthodes Nous avons comparé prospectivement les cultures séquentielles uniques et multiples. amplifications réactionnelles par clonage et / ou pyroséquençage d’abcès cérébraux chez des patients hospitalisés à Marseille, France, de janvier à décembre Résultats Les cultures obtenues ont identifié significativement moins de types de souches bactériennes que les souches de tests moléculaires; P =, par test d’analyse de variance Nous avons trouvé qu’un patient pouvait présenter autant d’espèces bactériennes différentes dans un seul abcès. Les cultures obtenues identifiaient différentes espèces déjà connues pour causer un abcès cérébral. Le séquençage unique était médiocre, alors que le séquençage multiple identifiait des espèces dont Notamment, nous avons observé des patients qui hébergeaient Mycoplasma hominis un pathogène émergent dans cette situation et des patients qui hébergeaient Mycoplasma faucium, qui, à notre connaissance, n’a jamais été rapporté dans la littératureConclusions Les techniques moléculaires de façon spectaculaire augmentation du nombre d’agents identifiés dans les abcès cérébraux Les espèces de mycoplasmes sont communes et doivent être détectées dans cette situation Ces résultats nous ont amenés à nous interroger sur l’exactitude du traitement empirique actuel des abcès cérébraux

L’abcès cérébral est une affection menaçant le pronostic vital, avec des séquelles graves fréquentes, pour lesquelles la prise en charge médicale reste empirique en raison d’un manque de connaissances sur les organismes responsables. La documentation microbiologique de l’abcès cérébral repose principalement sur l’examen microscopique direct et la Malheureusement, cette procédure produit des résultats non concluants dans% -% des cas, en fonction de la qualité de la culture anaérobie amplifié par PCR S séquençage de l’ADN ribosomique de l’ADNr a récemment été utilisé pour surmonter les limites de la culture détection de bactéries dans des échantillons de pus d’abcès cérébral, et il a été démontré qu’il était efficace pour documenter une infection monomicrobienne après un traitement antibiotique. Malheureusement, cette procédure n’a pas permis de distinguer la flore mixte En tant que tel, nous suspectons l’abcès cérébral est beaucoup plus grand que prévu Cette étude a consisté à analyser et évaluer la flore bactérienne responsable des abcès cérébraux en comparant la technique de culture standard aux techniques suivantes en utilisant l’amplification de l’ADNr: séquençage direct fournissant une seule séquence, séquençage multiple après clonage fournissant ~ différentes séquences et séquençage multiple par pyroséquençage à haut débit avec utilisation de la plate-forme Life Sciences-Roche Ces approches ont déjà été utilisées pour explorer la flore mixte dentaire, vaginale, pulmonaire et intestinale Les études de cas présentées ici indiquent un spectre extrêmement étendu d’espèces bactériennes associées au cerveau. abcès, y compris les espèces jamais décrites auparavant en rapport avec cette condition

Matériaux et méthodes

Patients et échantillons cliniques Cette étude inclut des patients ayant subi un drainage chirurgical d’abcès cérébral à Marseille, en France, entre janvier et décembre. L’abcès cérébral était défini comme un foyer suppuratif localisé visible par tomodensitométrie ou IRM et pour lequel l’analyse histologique a confirmé présence de pus et exclusion de la présence de cellules cancéreuses et lymphomateuses Des données démographiques ont été recueillies anonymement pour chaque patient et incluaient l’âge, le sexe, la source potentielle de contamination et les facteurs prédisposants sous-jacents. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique local. salles d’opération équipées de systèmes à flux laminaire et de filtres à particules à haute efficacité, utilisant des dispositifs stériles avec des procédures chirurgicales aseptiques dans des tubes stériles et immédiatement envoyés au laboratoire de bactériologie pour des études de culture et moléculaires

Méthodes de microbiologie Les échantillons de pus ont été examinés au microscope après coloration de Gram pour noter la présence de leucocytes polymorphonucléaires et de bactéries. Ils ont ensuite été étalés sur des plaques de gélose au sang et de gélose au chocolat. bioMärieux et incubés à ° C sous% CO et en conditions anaérobies Les plaques ont été examinées quotidiennement pour la présence de colonies au cours de jours. Des cultures bactériennes pures ont été obtenues à partir de colonies isolées et identifiées à l’aide de l’instrument Vitek Les cellules pulmonaires et endothéliales embryonnaires humaines ont été réalisées en utilisant la technique de centrifugation coque-flacon pour des échantillons conservés à-° C au cas où les milieux axéniques resteraient stériles. Les isolats ont été identifiés moléculairement par séquençage SADD dans l’abcès cérébral s La détection moléculaire a été réalisée par amplification de l’ADNr S et séquençage en utilisant des niveaux de profondeur. Amplicons peuvent être directement séquencés séquençage unique Dans certains échantillons, cela a été gênant, car les séquences démontrent une infection mixte. Nous avons d’abord testé différentes séquences après clonage dans Escherichia coli. Nous avons ensuite utilisé le pyroséquençage à haut débit sur les amplicons, ce qui nous a permis d’obtenir kb de séquence, c’est-à-dire différentes séquences du test. ] Les séquences d’ADNr S représentant de nouveaux phylotypes ont été déposées dans la table GenBank

Vue en grandDétailléesL’ADN ribosomique ADNr L’analyse moléculaire de la flore d’abcès cérébral à l’aide du séquençage direct et multiple FLEX a été fabriqué par Life Science-RocheFigure Voir en grandDownloads ADN ribosomique ADNr Séquence moléculaire d’abcès cérébral en utilisant le séquençage direct et multiple FLEX a été fabriqué par Life Science-Roche

Tableau View largeDownload slideCaractéristiques des patients atteints d’abcès cérébral examinés dans cette étude et des bactéries identifiées, par techniqueTable View largeTélécharger slideCaractéristiques des patients atteints d’abcès cérébral examinés dans cette étude et des bactéries identifiées, par techniqueDirect S rDNA PCR amplification et séquençage Après protéinase K traitement et lyse mécanique utilisant l’instrument FastPrep FP BIO Systems, ADN complet extrait des échantillons de pus à l’aide du kit d’isolation ADN MagNA Pure LC II et de l’instrument MagNA Pure LC Les contrôles Roche Negative, qui comprenaient de l’eau stérile au lieu de l’ADN, ont fonctionné en parallèle. Les produits de séquençage purifiés ont été analysés sur un analyseur génétique ABI PRISM X. Les séquences de biosystèmes appliquées assemblées à l’aide du logiciel SEQUENCHER Applied Biosystems ont été comparées à celles déposées. dans le National Centre d’information sur la biotechnologie Base de données GenBank utilisant le programme BLAST http: // wwwncbinlmnihgov Le gène de la β-globine a été amplifié en parallèle en utilisant la paire d’amorces KM ‘-GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-‘ et RS ‘-GCT CAC TCA GTG TGG Clonage de l’ADN S amplifié par PCR L’ADN S amplifié par PCR a été clone en utilisant le système pGEM-T Easy Vector System avec E coli Promega de JM compétent conformément aux instructions du fabricant. Pour chaque échantillon de pus, les colonies blanches ont été analysées par amplification PCR en utilisant les amorces universelles Md et les séquences Mr chimériques trouvées dans les banques en utilisant le programme CHIMERA_CHECK du Ribosomal Database Project II ont été exclues de l’analyseS pyroséquençage à haut débit. S ADNr amplifié à partir du spécimen d’un patient a été purifié et séquencé en utilisant la plate-forme GS FLX Life Sciences-Roche sur un × PicoTiterPlate PTP avec des régions Roche Reads exhib une similarité de séquence ⩾% et une couverture de% séquence avec n’importe quel hit dans le projet de base de données ribosomique II http: // rdpcmemsuedu / en utilisant l’algorithme BLAST ont été identifiées au niveau de l’espèce; lectures présentant une similitude de séquence% -% et une couverture de séquence ⩾% ont été identifiées au niveau du genre; et les lectures présentant une similarité de séquence & lt;% n’étaient pas classées Le nombre de lectures assignées à une espèce ou un genre donné a été calculé. Seules les espèces et les genres qui ont recueilli & gt; La fonction Nucmer du paquetage MUMmer a été utilisée pour cartographier les lectures classées dans une espèce sur la référence S rADN Paramètres par défaut utilisés Stratégie de recherche littéraire et critères de sélection La base de données PubMed a été recherchée pour les articles publié au cours du mois d’avril avec le terme de recherche combiné “cerveau ET abcès” Des articles supplémentaires ont été identifiés en effectuant une recherche manuelle dans les bibliographies des articles sélectionnés. La stratégie a été développée en divisant la revue en ses éléments élémentaires. bactériologie, «S», «moléculaire», «détection», «métagénomique», «Mycoplasma hominis», «Mycoplasma faucium» et «Mycoplasma orale». La langue de publication était limitée à l’anglais. recherché pour identifier les articles manquants dans la recherche dans la base de données

Résultats

Patients Vingt patients ont été inclus prospectivement dans ce tableau d’étude, y compris les patients de sexe masculin% et les patients de sexe féminin% L’âge moyen des patients était de plusieurs années, et il y avait des enfants âgés de & lt; Les céphalées étaient la manifestation clinique la plus fréquente et ont été observées chez les patients; une fièvre et une faiblesse motrice ont été observées chez les patients; des vomissements et / ou des nausées, des altérations de la conscience et une aphasie ont été observés chez les patients; des problèmes visuels ont été observés chez les patients; perte de poids a été observée chez les patients; d’autres manifestations neurologiques ont été observées chez les patients; des convulsions ont été observées chez des patients; et un vertige a été observé chez les patients et une IRM a détecté un seul abcès cérébral chez les patients% et de multiples abcès cérébraux chez les patients% Un abcès solitaire était localisé au lobe pariétal chez les patients, au lobe frontal chez les patients, au lobe occipital chez les patients, au lobe temporal chez les patients, à une localisation frontopariétale chez le patient, et à une localisation pariéto-occipitale chez le patient abcès cérébral après neurochirurgie chez les patients%, alors que l’infection contiguë après sinusite ou abcès dentaire était la deuxième source la plus fréquente d’abcès cérébral chez patients% Aggregatibacter aphrophilus pneumonia était une source possible de dissémination hématogène chez le patient, alors qu’aucune source primaire n’a pu être identifiée chez les patients% Des conditions sous-jacentes ont été observées chez les patients Les microbes ont révélé des bactéries chez les patients. ont donné des espèces bactériennes chez les patients%, et étaient stériles chez les patients% Les contrôles négatifs sont restés négatifs dans toutes les expériences de PCRDiscrepancements entre la culture et la détection moléculaire Les résultats de l’amplification PCR directe ont été négatifs pour l’échantillon et positifs pour les échantillons, y compris les cas où la flore mixte était détectée à cause de séquences troubles. Pire, par analyse de variance Parmi les séquences interprétables, Streptococcus intermedius a été détecté chez des patients canelle. Dans un échantillon, les mêmes espèces bactériennes ont été détectées par culture et séquençage direct du S-ADNc. Un échantillon ayant donné des résultats négatifs par détection de S-PCR ADN, le témoin positif à la β-globine a donné des résultats positifs montrant la présence d’espèces de Nocardia. Dans le cas, la culture a produit Klebsiella oxytoca, alors que le séquençage direct de l ‘ADN S a produit B fragilis. Pour les spécimens, les cultures ont donné des espèces de Streptococcus mélangées à une autre espèce bactérienne, ce qui correspond à Séquençage de SADAD direct indiquant la flore mixte Pour le spécimen, la culture a produit S intermedius et Staphylococcus epidermidis, alors que le séquençage direct de S rADN n’a identifié que S intermedius Pour l ‘échantillon, la culture a donné des espèces de Streptococcus, alors que le séquençage SdADN direct présentait une flore mixte. des inserts non chimériques de ~ bp ont été séquences, correspondant à & gt; Dans les échantillons, seules des espèces bactériennes identiques à celles détectées par séquençage direct de l’ADN S ont été détectées. Chez les patients, l’analyse de la banque de clones a identifié des bactéries qui n’avaient pas été trouvées en utilisant un tableau de séquençage. Dans ce cas, des espèces bactériennes ont été trouvées par culture, ont été trouvées par séquençage multiple après clonage, et ont été trouvées par figure de séquençage multiple à haut débit. Au total, des souches bactériennes ont été identifiées, comparées à l’espèce identifiée par culture P =, par analyse de variance test; infections mixtes ont été identifiés, par rapport à identifiés par la culture P = non significatif

Figure Vue largeTéléchargement Diapositive pus abcès cérébral coloré pus A pour un patient indiquant des cocci gram positif lorsque pyroséquençage haut débit démontré différentes espèces bactériennes délimitées dans un arbre phylogénétique valeurs bootstrap ⩾% sont indiqués aux nœuds; BFigure View largeTélécharger un slide Abcès cérébral coloré au gramme pus A pour un patient indiquant un cocci gram positif lorsque le pyroséquençage à haut débit a démontré différentes espèces bactériennes délimitées dans un arbre phylogénétique Les valeurs bootstrap ⩾% sont indiquées aux nœuds; B

Discussion

comme M hominis, Gemella morbillorum, Aphrophilus, et Fusobacterium necrophorum, était plus rapide avec la détection moléculaire qu’avec la culture En outre, la détection moléculaire identifié streptocoques chez les enfants qui ont reçu des antibiotiques avant la ponction abcès cérébral Le séquençage PCR est inadéquat pour les échantillons cliniques contenant une flore mixte; Cette approche a produit des séquences mixtes, non interprétables, comme décrit précédemment pour les échantillons d’abcès cérébraux Par conséquent, nous avons utilisé des approches complémentaires pour résoudre ce problème et permettre un séquençage multiple: analyse de banques de clones d’ADN s et de pyroséquençage à haut débit. Les auteurs ont trouvé d’excellents résultats, alors que les cultures ont récupéré des espèces bactériennes et que le séquençage unique n’a identifié que des espèces bactériennes et des populations mixtes d’amplicons positifs. Cette stratégie a également facilité l’identification de bactérie particulièrement exigeante, contrairement au séquençage unique. le nombre d’espèces de bactéries bactéries identifiées, en comparaison avec pour la culture [P =] et pour le séquençage unique [P =] La puissance du séquençage multiple a été démontrée chez le patient, pour qui les cultures ont donné des espèces bactériennes et le séquençage à haut débit trouvé b Nous soupçonnons que ces derniers cas résultent d’une contamination pendant la procédure d’inoculation. Le séquençage multiple a également identifié des patients avec des infections mixtes qui n’ont pas été détectées par séquençage direct ou culture. Nous avons détecté des anaérobies en utilisant seulement S amplification de l’ADNr en% de spécimens Ceci représente potentiellement un défaut dans notre laboratoire, car d’autres ont récupéré comparativement plus d’anaérobies par culture. Des développements ultérieurs en biologie moléculaire pourraient, à l’avenir, aider à éviter ce problème d’isolement anaérobie fastidieux. Nous avons détecté la présence de mycoplasmes espèces en% des spécimens; dans certains cas, les espèces de Mycoplasma faisaient partie d’abcès de la flore mixte et n’ont pas été détectées par séquençage direct. M hominis devrait être considéré comme un agent pathogène émergent dans les abcès cérébraux; nous avons détecté cette espèce dans des échantillons de pus provenant de patients%, et la détection de cette espèce a également été notée dans les rapports précédents [,,] M faucium est encore plus fastidieuse et n’a jamais été rapportée dans les abcès cérébraux. détectés par PCR ne sont probablement pas des résultats faussement positifs, car les contrôles négatifs sont restés négatifs dans tous les tests PCR. En outre, les organismes détectés ne sont pas connus en tant que contaminants environnementaux généraux et n’ont pas été détectés dans d’autres échantillons cliniques analysés. L’augmentation observée dans le répertoire des organismes causant des abcès cérébraux peut être liée à des preuves moléculaires pour des organismes exigeants et pourtant non cultivés. Nous avons observé des séquences qui correspondaient aux bactéries contemporaines non cultivées qui avaient été caractérisées flore parodontale et intestinale anaérobie Quatorze séquences appartenaient aux bacilles à Gram négatif Bact phylum eroidetes, et la séquence appartenait aux bacilles gram-positifs Firmicutes phylum ordre Clostridiales Dans une étude précédente de la flore buccale, il a été estimé que ~% des bactéries présentes étaient non cultivées et appartenaient à la Bacteroidetes et Firmicutes phyla Analyses à haut débit des bactéries associées aux abcès cérébraux dans notre étude ont révélé que la flore était encore plus variable que prévu, y compris les espèces bactériennes retrouvées dans les abcès cérébraux qui n’avaient pas été rapportés précédemment. Des résultats similaires ont été observés dans des études antérieures. De plus, les approches moléculaires nous ont souvent permis d’associer M faucium au développement d’abcès cérébraux pour la première fois, parce que espèce a été observée chez les patients M faucium est un habitant du primate oropharynx , et Elle a récemment été associée à une gastrite chronique chez des patients coréens Les autres espèces détectées chez des patients individuels sont des habitants normaux de la cavité buccale humaine, et comprennent Campylobacter gracilis , Mogibacterium timidum , Prevotella baroniae , Prevotella tannerae [ ], Peptostreptococcus stomatis , une nouvelle espèce de Neisseria , une nouvelle espèce de Capnocytophaga présentant une similitude de séquence% S rDNA avec des espèces Capnocytophaga non cultivées , et une nouvelle espèce Prevotella présentant une similitude de séquence% S rDNA avec Prevotella shahii avec les résultats de la table de littérature, des espèces observées dans notre étude n’ont jamais été annoncées auparavant dans les abcès cérébraux

Tableau View largeTélécharger les espèces bactériennes détectées chez différents patients par culture, séquençage direct de l’ADN ribosomique s ADNr, et / ou séquençage multiple de l’ADN ribosomique View largeDownload slideLes espèces bactériennes détectées chez différents patients par culture, S ADN ribosomique séquençage direct ADNr, et / ou S Séquençage multiple de l’ADNrEn conclusion, notre étude a déterminé que la variété des espèces bactériennes associées aux abcès cérébraux est beaucoup plus grande que ce qui a été rapporté auparavant, et comprend de nombreuses anaérobies et bactéries non cultivées provenant de la flore buccale Nous avons confirmé le rôle récemment annoncé de M hominis , et nous rapportons, pour la première fois, le rôle de M faucium Des études supplémentaires et les données rapportées ici pourraient potentiellement diriger des modifications aux traitements antibiotiques actuels d’abcès cérébral

Remerciements

Nous remercions le Prof. Hervé Richet pour sa contribution aux analyses statistiques. Soutien financier Programme National de Recherche Hospitalière de France “Etude mätagänomique des abcès cäräbraux” Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits