Les protéases à VIH provenant de patients africains pharmaco-naïfs sont différentiellement moins sensibles aux inhibiteurs de la protéase

Contexte Maintenant que le traitement antirétroviral hautement actif HAART est lancé à grande échelle en Afrique de l’Ouest, il reste controversé si les inhibiteurs de la protéase, initialement conçus et testés contre le sous-type B du virus de l’immunodéficience humaine, sont également efficaces contre les sous-types non B prévalents dans les pays d’Afrique de l’Ouest Dans cette étude, nous avons étudié si les isolats du VIH ghanéens, en tant que représentants des isolats d’Afrique de l’Ouest, sont sensibles aux PIsMethods. Nous avons d’abord généré un ADN proviral vecteur de la cassette protéase du VIH. Des protéases VIH dérivées à insérer et à soumettre à des tests génotypiques et phénotypiques Des gènes de protéase du VIH dérivés de patients ghanéens naïfs de traitement ont été utilisés dans cette expérience en tant que représentants de souches ouest-africaines. séquentiellement puis génétiquement comparé L’analyse phénotypique a été réalisée avec des Virus de l’otease-chimère en présence de différents IP Des modèles structuraux d’homodimères de protéase du VIH ont été construits par le logiciel de modélisation moléculaireRésultats L’analyse génétique de gènes de protéase du VIH clonés provenant de patients a indiqué que la plupart des protéases du VIH sont placées sous forme de souches CRF_AG , qui sont phylogénétiquement éloignées des souches de sous-type B, et que les protéases du VIH ghanéennes n’hébergent pas de mutations majeures connues influençant la pharmacorésistance mais portent généralement des mutations mineures. Une analyse phénotypique réalisée avec des virus recombinants de la protéase du VIH en présence de différents IP révèle À l’appui de cette découverte de susceptibilité différentielle, l’analyse structurale a montré une distorsion significative du nelfinavir, mais pas de l’amprénavir, dans la poche de protéase ghanéenne, suggérant que le nelfinavir pourrait être moins insérable dans la protéase ghanéenne que dans la protéase du sous-type BConclusions Ces résultats ont des implications pour la combinaison des IP pendant l’introduction de HAART en Afrique de l’Ouest

Depuis l’introduction du HAART dans les pays développés, le pronostic pour les patients infectés par le VIH s’est considérablement amélioré. En revanche, la population de patients nouvellement infectés par le VIH a explosé, en particulier en Afrique subsaharienne où la multithérapie est actuellement initiés à grande échelle Les inhibiteurs de la protéase, principaux médicaments utilisés dans le traitement antirétroviral hautement actif, ont été initialement conçus et testés contre les virus de sous-type B principalement répandus dans les pays occidentaux, alors que l’épidémie actuelle de VIH dans les pays africains est dominée par -B sous-types, tels que sous-type A, sous-type G, et sous-type CRF_AG dont la prévalence augmente rapidement Fait important, la constatation que les gènes protéases dans ces sous-types non B présentent une variabilité de séquence distincte de celle du sous-type B [- ] a soulevé la question de savoir si les IP seraient aussi efficaces contre les sous-types non-B. Fait intéressant, avec l’utilisation d’une approche biochimique, Velazquez-Campoy et al ont f Etant donné que les sous-types A et G ont moins de sensibilité aux IP que le sous-type B Étant donné que cette question est controversée, l’introduction des IP dans les pays en développement nécessite de répondre à cette question sur la base des sous-types VIH prédominants. Nous avons étudié si les isolats du VIH ghanéens, en tant que représentants d’isolats ouest-africains, sont sensibles aux IP. Nos résultats indiquent que les protéases du VIH ghanéennes – principalement classées sous le type CRF_AG – sont différentiellement moins sensibles aux IP, dans l’ordre suivant: nelfinavir = lopinavir & gt; indinavir & gt; saquinavir & gt; ritonavir & gt; À l’appui de ces résultats de susceptibilité différentielle, l’analyse structurale a montré une distorsion significative du nelfinavir mais pas de l’amprénavir dans la poche de protéase ghanéenne, suggérant que le nelfinavir pourrait être moins insérable dans la protéase ghanéenne que dans la protéase du sous-type B pour la combinaison des IP pendant l’introduction de HAART en Afrique de l’Ouest

Patients et méthodes

Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé approuvé par le Comité d’éthique institutionnelle du Noguchi Memorial Institute pour la recherche médicale. Des échantillons de patients à Accra ont été obtenus d’un hôpital militaire et ceux de Kumasi et Tamale ont été obtenus dans les hôpitaux locaux. Des antécédents de patients à Accra n’étaient pas disponibles Tous les patients étaient naïfs de traitement, et leurs échantillons ont été obtenus pendant une période allant de à et ont été analysés. pour cette étudeConstruction de virus recombinants Un ADN de vecteur de cassette de protéase du VIH a été généré en introduisant différents sites d’enzymes de restriction uniques, c’est-à-dire des sites de cassette, PvuI au niveau de l’acide aminé de la protéine transfameshift; Les sites PvuI situés dans pUC ont été perturbés pour rendre le nouveau site PvuI unique et Clal à l’acide aminé de RT, dans un fragment d’ADN de clone infectieux de pleine longueur du VIH portant un gène rapporteur luciférase, construction non publiée pNL-Luc-E. désigné comme pNL-Luc-ProCT Les gènes de protéase du VIH dérivés du patient ont été amplifiés avec PCR, digérés avec PvuI et Clal, purifiés et insérés dans le vecteur cassette de protéase du VIH pour générer un vecteur de cassette gag-pol pNL-Luc-gpCT, un site BlpI a été introduit en position nucléotidique au sein du gène vif de pNL-Luc-E par mutagenèse dirigée. Un fragment gag-pol de GH-AG, un clone proviral CRF_AG infectieux , a été amplifié par PCR, digéré par BssHII / BlpI, inséré dans pNL-Luc-gpCT, et désigné comme analyse pNL-Luc-AGgpSequence des gènes de la protéase Les gènes de protéase insérés dans l’ADN du vecteur cassette de la protéase du VIH ont été séquencés en utilisant un séquenceur d’ADN modèle ABI. et le Les séquences de protéases des souches de référence représentant les différents sous-types génétiques ont été alignées sur l’utilisation du programme Clustal W Un arbre phylogénétique construit par la méthode de jointure voisine avec la fiabilité des ordres de ramification obtenus par bootstrap a été implémenté avec le programme Clustal W Les séquences d’acides aminés des gènes de la protéase ont été comparées à une séquence consensus de sous-type B de la base de données de séquences de protéases de Stanford et ont été analysées pour les mutations associées à une sensibilité réduite aux tests de susceptibilité PIsDrug Brièvement, les cellules T subconfluentes dans des flacons de -cm ont été transfectées avec μg d’ADN plasmidique proviral du VIH en utilisant FuGene Roche. Après h, les cellules T transfectées ont été transfectées. trypsinisé et divisé en sous-cultures -μL dans des plaques -well en présence de concentrations croissantes d’IP,,,, et nM pour l’indinavir [Merck], le nelfinavir [tabac japonais] et le ritonavir [Abbott]; ,,,,, et nM pour le saquinavir [Roche]; ,,,,, et nM pour l’amprénavir [Kissei]; et,,,, et nM pour lopinavir [Abbott] Après h de traitement, les surnageants viraux ont été utilisés pour infecter les cellules MAGIC sous-confluentes dans les plaques -well Après h, les cellules ont été lysées dans μL de tampon de lyse Promega, et les activités luciférase ont été déterminées à l’aide d’un MicroLumat LB V Berthold La sensibilité des différents virus aux IP a été exprimée en IC et IC, déterminés sur la base de la courbe dose-réponse. La variation de la sensibilité au PI a été calculée comme le rapport IC ou valeurs IC pour les virus mutants à la valeur correspondante pour les virus de type sauvage Les résultats sont exprimés en valeur moyenne ± écart-type d’au moins des expériences indépendantes Les comparaisons des valeurs IC et IC ont été effectuées avec l’analyse de variance test AP valeur de & lt; Nous avons obtenu la structure cristalline de l’homodimère de la protéase du VIH avec le nelfinavir à une résolution de A à partir de la banque de données sur les protéines de la Banque de Données sur les Protéines , OHR The -dimensional – Les modèles D d’un homodimère de protéase du VIH ont été construits en utilisant la technique de modélisation d’homologie MOE, version chimique. Les structures -D ont été optimisées thermodynamiquement par minimisation d’énergie en utilisant MOE et le champ de force CHARMm. Structures locales physiquement inacceptables les modèles -D optimisés ont été affinés sur la base de l’évaluation par le graphique Ramachandran et le graphique using en utilisant MOE Le complexe de la structure protéase et nelfinavir a été généré avec le programme de simulation d’amarrage AS_Dock Ryoka Systems, qui est opéré dans MOE , Ebind, a été calculé, comme décrit ailleurs , où Ecomplex est e énergie d’un complexe enzyme-inhibiteur, Eenzyme est l’énergie de l’enzyme, et Einhibitor est l’énergie de l’inhibiteur Chaque valeur a été calculée par le MEO

Résultats

CRF_AG Dans cette étude, nous avons tenté de déterminer si les sous-types non B qui sont actuellement prévalents en Afrique de l’Ouest et en particulier au Ghana où les sous-types A, G et CRF_AG sont connus pour être aussi répandus que Nous avons d’abord généré un vecteur de cassette de protéase du VIH en introduisant des sites d’enzymes de restriction uniques et des gènes clonés de protéase du VIH clonés dans les sites de cassette du vecteur. Les gènes de protéase de la protéase du VIH résultante La figure montre le résultat d’une analyse phylogénétique contenant des séquences de protéases dérivées des sous-types AK, des souches CRF_AG et des protéases ghanéennes séquencées dans cette étude. Cet arbre a pu représenter la classification claire de chaque sous-type simplement sur le base de la différence entre les séquences de protéase En outre, la plupart des protéases ghanéennes nouvellement Les sous-types A, G et CRF_AG, y compris les souches ghanéennes, se sont révélés éloignés phylogénétiquement des souches de sous-type B

Figure Vue largeDisque de téléchargement Arbres phylogénétiques non localisés basés sur des séquences de protéase du VIH provenant de souches de référence du groupe M représentant les différents sous-types représentés en noir et provenant d’isolats ghanéens nouvellement séquencés en bleu L’arbre a été généré comme décrit dans Patients and MethodsFigure Séquences de protéase du VIH provenant de souches de référence du groupe M représentant les différents sous-types montrés en noir et d’isolats ghanéens nouvellement séquencés en bleu L’arbre a été généré comme décrit dans Patients et méthodesPatterns des mutations des acides aminés dans les protéases du VIH ghanéennes. les séquences d’acides aminés entre les protéases ghanéennes et le consensus de sous-type B de la base de données de séquences protéiques de Stanford VIH Comme montré sur la figure, aucune mutation majeure influençant la résistance aux médicaments, par exemple DN, GV, IV, VA / I, IV ou LM observés dans les gènes de la protéase ghanéenne. D’autre part, des variations mineures communément trouvé dans toutes les protéases ghanéennes aux positions KI et MI, et d’autres ont été observés relativement fréquemment dans certains échantillons ghanéens aux positions échantillons LV / I [%] et échantillons LS / F / P [%] Autres variations de séquence non encore associées à la résistance aux médicaments ont été observés dans presque tous les clones ghanéens, comme suit: IV, RK, HK et LM Parmi ces mutations, IV a été spécifiquement observée dans les sous-types A, G et CRF_AG, et KI a été observée dans les sous-types G et CRF_AG; Dans l’ensemble, les mutations RK, HK et LM ont été fréquemment observées dans presque tous les sous-types non B de la base de données. Globalement, les mutations du gène de protéase observées ici étaient généralement similaires à celles précédemment rapportées pour les isolats CRF_AG [,,,,,,]

Les séquences ont été alignées sur une séquence consensus de sous-type B de la base de données de séquences de protéases du VIH de Stanford. Les points indiquent une identité avec les isolats consensus. Les séquences de protéase montrées dans Les séquences ont été alignées sur une séquence consensus de sous-type B de la base de données de séquences de protéases du VIH de Stanford. Dots indiquent que ces séquences ont été alignées avec une séquence consensus de sous-type B de VIH. identité avec les isolats consensus Les séquences de protéase montrées dans cette figure ont été assignées GenBank accession non Les protéases du VIH AB-ABGhanaian sont différemment moins sensibles aux PI Pour déterminer si les protéases ghanéennes pourraient être sensibles aux IP, nous avons effectué un test de sensibilité aux médicaments, comme décrit dans Patients and Méthodes Huit différents virus dispersés phylogénétiquement et géographiquement ont été sélectionnés pour le test. Comme le montre la figure, les protéases du VIH ghanéennes présentaient différents niveaux de sensibilité aux inhibiteurs selon la combinaison de protéases et de médicaments. La plupart des protéases ghanéennes se sont avérées reproductibles et considérablement moins sensibles aux protéases de nelfinavir avec une variation de> IC ou IC comprise entre A, K et T; ceux avec un changement de – ont inclus A, K, et T et les protéases de lopinavir avec un changement de & gt; dans CI ou IC inclus K, K et T; ceux avec un changement de –fold inclus A, K et T; P & lt; et modérément moins sensibles aux protéases indinavir avec A – fold-change inclus A, A, A, K, K, K, T et T et protéases saquinavir avec un – changement de changement inclus A, K, K et T, tandis que Nous avons donc conclu que, comparées à la protéase de sous-type B, les protéases du VIH ghanéennes sont différentiellement moins sensibles aux IP, ce qui montre une susceptibilité relativement forte aux autres médicaments, le ritonavir et l’amprénavir. dans l’ordre suivant: nelfinavir = lopinavir & gt; indinavir & gt; saquinavir & gt; ritonavir & gt; amprenavir

Vue de la figure grandDownload diapositive Sensibilité aux inhibiteurs de protéase dans HIV-protéases obtenues d’individus naïfs de drogue au Ghana Les données sont les valeurs IC et IC moyennes d’au moins des expériences indépendantes Les comparaisons des valeurs IC et IC ont été effectuées avec l’utilisation de l’analyse de variance suivie par La valeur AP de test t de Dunnett de & lt; a été considéré comme statistiquement significatif. Les barres indiquent SD APV, amprénavir; IDV, indinavir; LPV, lopinavir; NFV, nelfinavir; RTV, ritonavir; SQV, saquinavir * P & lt; vs NL-Figure View largeDownload slideSusceptibilité aux inhibiteurs de la protéase dans les protéases à VIH obtenues à partir d’individus naïfs au Ghana Les données sont des valeurs IC et IC moyennes d’au moins des expériences indépendantes Les comparaisons des valeurs IC et IC ont été réalisées avec l’analyse variance suivie de la valeur AP du test t de Dunnett de & lt; a été considéré comme statistiquement significatif. Les barres indiquent SD APV, amprénavir; IDV, indinavir; LPV, lopinavir; NFV, nelfinavir; RTV, ritonavir; SQV, saquinavir * P & lt; La structure du nelfinavir dans la poche de la protéase G du Ghana est significativement déformée Enfin, nous avons examiné si la différence de sensibilité aux médicaments entre les sous-types B et les protéases ghanéennes illustrée correspondait à celle du modèle -D de la protéine protéase. la structure chevauchante de l’homodimère de la protéase du VIH de NL- et l’une des protéases ghanéennes, K Aucune différence majeure dans le squelette de la protéase entre NL- et K n’a été observée De façon surprenante, l’interaction protéase / nelfinavir, analysée par une molécule moléculaire. simulation d’amarrage, a révélé une distorsion structurelle significative du nelfinavir dans la poche B de la protéase K, comparée à la protéase NL D’autre part, aucune différence structurale d’amprénavir n’a été observée dans les données d’interaction protéase / amprénavir non démontrées. que l’énergie de liaison entre la protéase K et le nelfinavir, calculée selon la formule donnée dans Patient s et Methods, se sont révélés être – respectivement inférieurs à ceux de NL-protéase / nelfinavir – et – kcal / mol, alors que l’énergie de liaison entre K et l’amprénavir était presque équivalente à celle de NL-protéase / amprénavir – et – kcal / mol, respectivement Ces résultats impliquent que le nelfinavir, mais pas l’amprénavir, pourrait être moins insérable dans la poche de protéase du VIH ghanéenne que dans celle du sous-type B

Figure Vue largeTélécharger des modèles structurels des protéases du VIH La modélisation tridimensionnelle des protéases K et NL a été réalisée à l’aide du Molecular Operating Environment, version Chemical Computing Group A, squelettes de la chaîne principale chevronnés du NL- dans les protéases blanches et K bleu B, amarrage moléculaire du nelfinavir et de la protéase à gauche NL et K à droite Nelfinavir est représenté en jauneFigure vue largeTélécharger des modèles structurels de protéases à VIH La modélisation tridimensionnelle des protéases à K et NL a été réalisée en utilisant le Molecular Operating Environment, version Le groupe A du calcul chimique, les squelettes de la chaîne principale chevronnés de NL- dans les proteases blanches et K dans le bleu B, l’amarrage moléculaire du nelfinavir et de la protéase de la NL gauche et de la K droite Nelfinavir est représenté en jaune

Discussion

dy d’Ouganda , où les sous-types A, C et D sont prévalents,% des patients ayant reçu un traitement antirétroviral incluant un IP pendant des années avaient des virus résistants au moins à un médicament non spécifié, mais un taux inférieur de le groupe de patients recevant un traitement à base d’IP par rapport à un groupe de patients recevant un traitement non basé sur PI [Adje-Toure et al.] a rapporté que% de patients infectés par le sous-type CRF_AG en Côte d’Ivoire Les antirétroviraux à base de nelfinavir ont développé des mutations de résistance majeures au cours de l’année de suivi Ces données antérieures proviennent de patients recevant différents types d’IP, et sont donc discordantes les unes avec les autres Globalement, si un IP est cliniquement efficace chez des patients ouest africains Les sous-types A, G ou CRF_AG restent peu clairs. Dans notre étude, des conclusions peuvent être tirées. Premièrement, nous n’avons pas détecté de mutations majeures influençant la résistance aux médicaments dans les gènes de protéase dérivés de patients ghanéens naïfs. s Néanmoins, nous avons réussi à démontrer une différence structurale majeure dans la liaison protéase par le nelfinavir entre la protéase d’une souche de sous-type B et celle d’une souche VIH ghanéenne, malgré la structure similaire des principales chaînes des deux protéases Ceci est parfaitement cohérent avec les résultats obtenus dans le dosage de médicament. Cette observation était supportée par une différence dans l’énergie de liaison entre la protéase et le nelfinavir. Deuxièmement, notre test de médicament a été réalisé simplement en utilisant des virus protéase-cassette contenant seulement la protéase dérivée du patient gènes, bien que plusieurs études aient suggéré que la sensibilité à l’IP est affectée non seulement par des modifications de la protéase en soi, mais aussi par des changements dans d’autres régions, comme p / pgag et pgag. Nous avons donc également construit un virus recombinant. clone pNL-Luc-AGgp; voir Patients et Méthodes qui abritaient un gène gag-pol A / G recombinant dérivé et testé sa sensibilité aux médicaments Les données obtenues ont montré une faible sensibilité de ce virus aux inhibiteurs des données testées non montrées, comme on peut le voir sur la figure. indique que nos résultats basés sur le gène de la protéase reflètent le phénotype sensible au PI dans les sous-types de virus CRF_AGTroisièmement, notre test de drogue a détecté avec succès les légères modifications de la sensibilité au PI des protéases du VIH obtenues chez des patients ghanéens. Le lopinavir, l’indinavir ou le saquinavir étant relativement peu nombreux, presque toutes les protéases testées présentaient des taux d’augmentation statistiquement significatifs, ce qui suggère que cette légère augmentation est intrinsèque aux protéases ghanéennes du VIH-CRF_AG Comme précédemment proposé par Little et al , le niveau limité de suppression virale in vivo pourrait permettre des cycles supplémentaires de réplication virale en présence de médicaments antirétroviraux Cette hypothèse a été soutenue par nos données préliminaires, dans lesquelles les virus de la protéase recombinante K du Ghana étaient capables de se multiplier – plus que NL – dans les lymphocytes primaires en présence de la même concentration de nelfinavir Quatrièmement, nous avons pu observer l’effet inhibiteur du ritonavir sur les protéases du VIH en Afrique de l’Ouest Le ritonavir est un puissant inhibiteur de l’isoenzyme A, une sous-unité du système enzymatique du cytochrome P, et de petites doses de ritonavir Les niveaux plasmatiques de presque tous les IP Par coïncidence, le nelfinavir – auquel les isolats ghanéens présentaient la plus faible sensibilité parmi les IP – est le seul médicament avec lequel le ritonavir ne doit pas être associé car les concentrations plasmatiques de médicaments n’augmentent pas significativement. proposent que la combinaison de ritonavir et d’autres IP que le nelfinavir soit encore cliniquement applicable pour compenser le faible degré d’IP modifié Nous avons tenté de montrer une corrélation entre les profils de mutation de la protéase et le niveau de sensibilité réduite à l’IP. Les résultats obtenus ont toutefois montré une réduction similaire de la sensibilité aux IP des isolats ghanéens utilisés Bien que l’accumulation de mutations non associées à la pharmacorésistance semble être liée au niveau de sensibilité réduite aux médicaments, il serait difficile de tirer des conclusions. Les informations sur la résistance aux IP pourraient être limitées parce que la base de données de Nous pourrions donc avoir besoin d’une base de données sur les résistances de type B non-sous-type pour mieux comprendre le rôle de ces mutations. Notre étude pourrait avoir des limites supplémentaires, comme un petit nombre d’échantillons de patients et une simplification in vitro. Les tests de pharmacorésistance avec des IP nouvellement développés, tels que l’atazanavir, seront également importan Cependant, nos résultats ont des implications pour la combinaison d’IP à utiliser dans le traitement HAART en Afrique de l’Ouest et, par conséquent, pour le succès de ce traitement.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Sena Matrevi pour son assistance technique en matière d’études génétiques; Dr Bryan R Cullen, pour une lecture critique du manuscrit; Tomoki Yoshikawa, pour le soutien statistique; Dr Masashi Tatsumi, pour avoir fourni des cellules MAGIC; Merck, Roche, JT, Kissei et Abbott pour fournir des IP; Prof Alexander Nyarko, pour des discussions utiles; Le travail a été financé en partie par une subvention du Ministère de l’éducation, de la science, de la technologie, des sports et de la culture du Japon. Un soutien supplémentaire a été reçu de la part de l’International Medical Agency. Centre of Japan Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: no conflicts