Diagnostic de la mucormycose cutanée due à Rhizopus microsporus par une méthode innovante de polymorphisme de longueur de fragment de restriction par PCR

SirMucormycose est une infection opportuniste causée par des champignons saprophytes appartenant à la classe Zygomycetes et l’ordre Mucorales Ces moisissures vivent dans le sol, l’air, la matière en décomposition, et des substrats tels que les fruits, les céréales et les pains, et les infections rhinocérébrales, pulmonaires, manifestations gastro-intestinales, cutanées et disséminées Les facteurs de risque comprennent le diabète, la leucémie, la greffe de moelle osseuse, la chimiothérapie immunosuppressive, l’utilisation d’antibiotiques à large spectre et la rupture de la barrière cutanée. Nous rapportons une étude qui suggère l’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase PCR et l’analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction est un outil prometteur pour un diagnostic précoce et un traitement ciblé de la mucormycose Une femme âgée présentée au unité de soins intensifs médicaux avec choc septique dans le contexte d’un lymphome B agressif, dia gnosée un mois avant Elle a été sous sédation, a subi une intubation et une ventilation mécanique, et elle a reçu un soutien vasoactif chimiothérapie antinéoplasique contre le lymphome a été rapidement initié résultats microbiologiques révélés Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilose rare, et cytomégalovirus, et il y avait un important syndrome inflammatoire le C-réactive Le taux de protéine était de mg / L et le taux de procalcitonine était de ng / mL. Dix jours après l’admission à l’unité de soins intensifs, la patiente développait rapidement des lésions sur le dos qui évoluaient vers un aspect nécrotique. Une large incision chirurgicale locale des lésions nécrotiques a été réalisée. De nombreuses hyphes fongiques larges et aseptiques ont été identifiées dans les structures épidermiques et dermiques par coloration histologique. Cette matrice a été classée au microscope comme une espèce de Rhizopus sur la base de la présence de stolons, de rhizoïdes pigmentés bruns, de sporangiophores et d ‘apophyses sporangiabothes globulaires et de columellés.

Figure Vue largeDownload slideFigure Caractéristiques microscopiques des espèces de Rhizopus isolées à partir de la préparation de culture de bleu de lactophénol; Les sporangiophores sont longs et non-sporulés, se terminant généralement par de grands sporanges globuleux Les rhizoïdes proviennent de la base des sporangiophores Les stolons s’étendent latéralement à partir du noduleFigure microscopique des espèces de Rhizopus isolées à partir de la culture Préparation du lactophénol bleu; Les rhizoïdes proviennent de la base des sporangiophores Les stolons s’étendent latéralement à partir du nœud Le diagnostic de mucormycose cutanée primaire semble probable parce que les échantillons respiratoires et sanguins sont négatifs pour les zygomycètes. traitement antifongique et l’utilisation d’amines vasopressives, le patient a connu une défaillance multiviscérale, et est mort après des jours dans l’unité de soins intensifsUsing PCR et analyse de polymorphisme de longueur de fragment de restriction, nous avons confirmé rétrospectivement l’identification du genre Rhizopus et trouvé les espèces spécifiques à Rhizopus microsporus ciblé une séquence -bp dans le gène ribosomique S fongique avec exclusion de l’ADN humain, puis digestion avec des enzymes de restriction permettant une identification spécifique au niveau du genre et de l’espèce L’amplicon a ensuite été digéré par les enzymes de restriction PpuMI, AflII, BmgBI et AclI,respectivement comme spécifique pour les genres Rhizomucor, Mucor et Rhizopus, et pour Absidia corymbifera. Comme attendu à partir des résultats de l’examen mycologique, la digestion avec BmgBI a conduit à des fragments bp et bp de longueur. Le produit de PCR n’a pas été digéré par PpuMI, AflII et AclI. l’amplicon cible ne possède aucun site de restriction pour ces enzymes. Ces résultats ont confirmé la présence d’une espèce de Rhizopus, et un second cycle de digestion avec AseI a révélé des caractéristiques spécifiques de R microsporus ou de R azygosporus Sur la base de données épidémiologiques et cliniques, R microspore a été trouvé être probablement impliqué dans cette infection

Figure vue largeDownload slideFigure amplification PCR et les modèles de digestion de restriction-enzyme pour un échantillon de biopsie clinique à partir de la lésion cutanée d’un patient Lane âgé de -bp; voie, produits PCR non digérés; voie, digestion spécifique BmgBI des espèces de Rhizopus, voie, digestion spécifique AseI pour Rhizopus microsporus var rhizopodiformis et R azygosporus le fragment -bp n’est pas clairement identifiable en raison de sa petite taille; voie, PCR sans ADN contrôle négatifFigure Vue largeDownload slideFigure Amplification par PCR et schémas de digestion par restriction-enzyme pour un échantillon de biopsie clinique à partir de la lésion cutanée d’un patient âgé de plus d’un an Lane, échelle bp; voie, produits PCR non digérés; voie, digestion spécifique BmgBI des espèces de Rhizopus, voie, digestion spécifique AseI pour Rhizopus microsporus var rhizopodiformis et R azygosporus le fragment -bp n’est pas clairement identifiable en raison de sa petite taille; voie, PCR sans contrôle négatif de l’ADNL’apparition de la mucormycose chez les patients immunodéprimés est en augmentation, et les médecins traitant les patients en réanimation doivent être conscients de ces infections émergentes mortelles Aujourd’hui, le diagnostic de mucormycose repose sur des analyses d’échantillons cliniques par microscopie et culture Malheureusement, la récupération des zygomycètes à partir des tissus peut être problématique, et la détection fongique est souvent entravée par l’absence de croissance fongique en culture Par conséquent, le diagnostic est souvent posé après un délai trop long ou même postmortem. ces infections sont constituées de fortes doses d’amphotéricine B, associées au débridement chirurgical et au contrôle de la maladie sous-jacente. De plus, des différences ont été notées dans les susceptibilités in vitro des genres et espèces de la classe des Zygomycètes aux antifongiques disponibles. efficace contre Rhizopus que contre les genres Absidia ou Mucor Cet hétérogène La discrimination entre les espèces de Mucorales appartenant à un même genre doit généralement être effectuée par un laboratoire de référence Ainsi, fréquemment, lorsqu’ils tentent d’identifier les champignons, les cliniciens adoptent une approche alternative et utilisent des amorces panfongiques pour l’ADN. Séquençage Récemment, Kontoyiannis et al ont rapporté un taux de discordance% entre les résultats des méthodes morphologiques et séquentielles utilisées pour déterminer les genres fongiques. Par conséquent, nous proposons l’utilisation d’un test moléculaire permettant une identification rapide des Mucorales au genre et au D’autres études sont maintenant clairement justifiées pour évaluer prospectivement l’exactitude de la PCR et du polymorphisme de longueur de fragment de restriction sur des échantillons cliniques par rapport aux méthodes classiques. La PCR et l’analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction pourraient alors devenir un outil diagnostique facile à utiliser. stratégie thérapeutique ou préemptive ciblée A utiliser plus tôt contre cette infection potentiellement mortelle

Remerciements

Nous remercions le Dr Quentin Vicens pour son aide précieuse dans la vérification de nos conflits d’intérêts potentiels en anglais. Tous les auteurs: aucun conflit